Характеристики геномов условно-патогенных бактерий зоогенных экосистем островов Западной Арктики

Введение. Одним из существенных результатов развития теории природной очаговости в последние десятилетия является разработка и внедрение в качестве инициативы Всемирной организации здравоохранения стратегии эпидемиологического надзора за инфекциями, общими для человека и животных, известной как подход «Единого здоровья» (One Health approach) [1–4]. Данный подход декларирует необходимость микробиологического мониторинга возбудителей инфекционных заболеваний и детерминант лекарственной устойчивости в человеческом обществе, популяциях сельскохозяйственных и домашних животных, а также в природных экосистемах. Следует указать, что спектр природно-очаговых инфекций в XXI веке существенно дополнен новыми нозологическими формами и включает в качестве возбудителей инфекций у человека, наряду с облигатными патогенами, условно-патогенные микроорганизмы [5] что существенно расширяет задачи программ микробиологического мониторинга в «дикой природе».

Экосистемы полярных регионов планеты представляют особый интерес в качестве объектов мониторинговых исследований как конечные ареалы сезонных миграций перелетных птиц и ряда млекопитающих и в качестве чувствительных индикаторов состояния природной среды, на которую воздействуют климатические изменения и хозяйственное освоение территорий.

В высокоширотной Арктике известны природные очаги опасных инфекционных заболеваний, в частности бешенства [6], зоонозного гриппа А [7], сибирской язвы [8].

Однако объем информации об эпидемическом потенциале условно-патогенных бактерий, о распространении детерминант антибиотикорезистентности явно недостаточен, что увеличивает востребованность исследований микробиоты, ассоциированной с арктическими животными.

Цель исследования: оценка эпидемического потенциала условно-патогенных бактерий, ассоциированных с животными арктических островов Баренцева и Карского морей.

Материалы и методы. В ходе экспедиций «Арктический плавучий университет» в 2021–2022 годах на островах западного сектора Арктики (остров Вайгач, остров Северный архипелага Новая Земля, острова Гукера и Белл архипелага Земля Франца-Иосифа) было отобрано 46 образцов биологического материала, ассоциированного с мигрирующими животными, в том числе птицами. География мест отбора проб представлена на рисунке.

Асептически взятые пробы (фекалии белого медведя, птиц отряда гусеобразных, субстрат из нор грызунов и из орнитогенных почв на птичьих базарах) помещали в пробирки со стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:10, а затем культивировали на плотных питательных средах – на агаре Эндо и хромогеном UTI агаре (HiMedia, Индия), инкубируя при температуре 35–37 градусов в переносном термостате непосредственно на борту научно-экспедиционного судна «Михаил Сомов» и научно-исследовательского судна «Профессор Молчанов». В целях выделения доминирующих в материале культур микроорганизмов использовали прямой посев на плотные питательные среды, то есть метод обогащения на жидких питательных средах не применялся.

Геномы выделенных штаммов микроорганизмов были секвенированы с использованием технологии Illumina MiSeq (ресурсный центр «Биобанк», СПбГУ).

Библиотеки фрагментов ДНК готовили с использованием метода ультразвуковой фрагментации ДНК. Качество полученных библиотек оценивали с помощью анализатора Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, США). Необработанные данные считывались после контроля качества, выполненного с помощью FastQC v0.11 (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) были собраны de novo при помощи геномного ассемблера SPAdes 13.0 (https://github.com/ablab/spades), функциональная аннотация геномов осуществлялась с использованием онлайн приложения RAST (https://rast.nmpdr.org/).

Результаты. В настоящем исследовании охарактеризованы геномы нескольких выделенных из биологического материала штаммов. Информация об источниках их выделения представлена в табл. 1.

Как видно из данных, представленных в табл. 1, описанные штаммы бактерий выделены из зоогенного биологического материала, собранного на островных территориях западного сектора Российской Арктики между 69° и 79° северной широты.

Основные сведения о размере геномов, и особенностях геномных последовательностей представлены в табл. 2.

Обсуждаемые штаммы располагают геномами типичных для соответствующих видов бактерий размеров и GC-содержания.

Результаты геномного аннотирования, представленные в табл. 2, свидетельствуют о наличии генов вирулентности в геномах всех изученных штаммов, что позволяет рассматривать эти бактерии в качестве потенциальных патогенов. Так, геном Aeromonas salmonicida ABM14 содержит опероны синтеза RTX-токсина и внеклеточной протеазы (вибриолизина), сходной с эластазой синегнойной палочки. В геномах иерсиний (Yersinia kristensenii 2 guk и Yersinia rochesterensis 12bell) присутствуют гены факторов патогенности – сидерофоров энтеробактинового, и аэробактинового кластеров, а также гены белков секреции 6-го типа, пили 4-го типа, гены гемолизина ShlB/FhaC/HecB семейства и фосфолипазы С. Кроме того, в геномах иерсиний идентифицируется также энтеротоксин YtxA, а в геноме Y. kristenseinii присутствует также ген инвазина inv В составе генома Serratia fonticola Vf_lemm обнаруживаются гены системы секреции T6SS, включая ген hcp.

В составе геномов всех изученных бактерий обнаруживаются гены резистентности к антибиотикам, включая бета-лактамазы классов A, B, C, гены устойчивости к хинолонам (ген QnrB10, за исключением генома Aeromonas salmonicida ABM14). Геномы Aeromonas salmonicida ABM14 и Yersinia kristensinii 2guk также располагают генами эффлюкс-помп (MFS, MacA, MacB), обеспечивающих устойчивость к антибиотикам тетрациклинового ряда.

Обсуждение. При оценке эпидемического потенциала выделенных бактерий мы исходили из понимания этого показателя как совокупности свойств микроорганизма, определяющих способность вызывать эпидемический процесс [9]. С этой точки зрения мы можем оценить изученные штаммы условно-патогенных бактерий как обладающие выраженным эпидемическим потенциалом, что подтверждается наличием в их геномах генов вирулентности и устойчивости к антибиотикам.

Так, например, в геноме Aeromonas salmonicida ABM14 обнаружен оперон синтеза RTX — токсина, экспрессия которого, судя по проведенным ранее исследованиям [10], способна индуцировать апоптоз эпителиальных клеток хозяина, что в совокупности с наличием в геноме данного штамма эластазы (фермента, способного ингибировать фагоцитоз [11]) может обеспечить инвазию патогена в ткани организма теплокровного хозяина и генерализацию инфекции.

Примечательно также обнаружение энтеротоксина YtxA, относящегося к группе токсинов коклюшного типа AB5, в геномах Yersinia kristensenii 2 guk и Yersinia rochesterensis 12bell. Представители данной группы токсинов, как было установлено ранее [9], получили распространение в популяциях патогенных энтеробактерий, в частности энтеропатогенных эшерихий и сальмонелл.

Обнаруженный в геноме Yersinia kristensenii 2 guk ген инвазина inv, известен как ген вирулентности, обеспечивающий повреждение клеток кишечного эпителия животных [13].

В геноме Serratia fonticola Vf_lemm идентифицирован ген hcp. Пептиды, продуцируемые гомологами этого гена у патогенных иерсиний, участвуют в аутоаггрегации клеток [14], а у сальмонелл его гомологи являются факторами патогенности [15].

Резистом изученных бактерий не содержит критически значимых для общественного здравоохранения детерминант множественной лекарственной устойчивости, однако наличие генов беталактамаз различных классов и эффлюксных помп может обеспечить им постепенную адаптацию к существованию в экосистемах с умеренной концентрацией антибиотиков в урбанизированных и сельскохозяйственных биогеоценозах и специфической госпитальной среде.

Несмотря на то, что выявление на арктических территориях психрофильных представителей семейства Yersiniaceae, а также обнаружение в прибрежных биотопах Aeromonas salmonicida (возбудителя заболеваний рыб [16]), является, в целом ожидаемым, по нашему мнению, важен факт обнаружения штаммов, обладающих патогенным потенциалом и детерминантами резистентности из образцов биоматериала, ассоциированного с перелетными птицами и из проб, связанных с животными – аборигенами арктических островов и побережий.

Как предполагается, появление устойчивых к антибиотикам бактерий в природной среде Арктики, является результатом как мобилизации аутохтонного резистома, так и антропогенного загрязнения [17–19]. Наряду с этим, в распространение антибиотикорезистентных бактерий существенный вклад вносят мигрирующие животные, часть которых (дальнеперелетные птицы) выполняют функцию векторов переноса детерминант антибиотикорезистентности на большие расстояния. При этом северные олени, например, могут быть использованы в качестве индикаторов распространенности антибиотикорезистентных микроорганизмов в арктических экосистемах [20].

Примечателен факт обнаружения штамма условно-патогенной бактерии Yersinia kristensenii в составе микробиома белого медведя (Ursus maritimus) в образце с острова Гукера (Земля Франца-Иосифа). Известно, что белые медведи баренцевоморской субпопуляции (из карско-баренцевоморской популяции), которые встречаются на островах Земли Франца-Иосифа, ведут оседло-кочевой образ жизни и могут заходить в восточные районы Шпицбергена [21]. Таким образом, белые медведи тоже могут участвовать в распространении патогенов на обширных арктических территориях, а природные очаги, образованные этими животными, вероятно, не имеют четких границ и ограничены диапазоном их сезонных миграций. Положение белого медведя на вершине трофической цепи в арктической экосистеме, его высокая мобильность, а также присутствие этого хищника в антропогенно-измененных биотопах вблизи полярных станций и поселений позволяет использовать его кишечный микробиом в качестве индикатора интродукции антибиотикорезистентных бактерий, включая и возбудителей зоонозов. В недавнем исследовании отмечалось, что «следы» антропогенного воздействия присутствуют в виде изменений структуры микробиома белых медведей [22].

Выделение двух представителей семейства Yersiniaceae в одинаковых и экстремальных климатогеографических условиях – Yersinia kristensenii и Yersinia rochesterensis – требует отдельного рассмотрения и осмысления. Сам род Yersinia на июнь 2021 года включают 26 видов иерсиний. Причем в последние десятилетия он прирастает новыми видами благодаря молекулярно-генетическим исследованиям ранее обнаруженных классическими бактериологическими методами видов иерсиний. Таким примером является выделение из вида Yersinia kristensenii новых видов, в том числе и описанного в данной статье Yersinia rochesterensis [23].

Учитывая психрофильные свойства семейства Yersiniaceae и многочисленные находки иерсиний в высоких широтах, целесообразен поиск этих бактерий с широким привлечением внимания научно-практических специалистов к так называемым «игнорируемым» видам Yersinia enterocolitica-like bacteria, многие из которых являются возбудителями сапрозоонозов [24][25].

Заключение. В результате проведенных исследований получены данные, подтверждающие возможность циркуляции условно-патогенных бактерий, обладающих генами вирулентности, антибиотикорезистентности и определенным эпидемическим потенциалом в природных экосистемах арктических островов, включая высокоширотные территории с суровыми природно-климатическими условиями, в частности, впервые описаны штаммы иерсиний с островов архипелага Земля Франца-Иосифа.

Активное развитие познавательного туризма и освоение природной среды Арктики с ее стратегическим экономическим потенциалом предполагает учет возможности функционирования на арктических островах специфических природных очагов зоонозных инфекций, поддерживаемых мигрирующими представителями орнитофауны и териофауны.