Сравнительный анализ методов отбора проб смывов с объектов внешней среды для оценки вирусно-бактериальной контаминации

Введение. Одним их ключевых элементов системы эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями является микробиологический мониторинг контаминации объектов окружающей среды (ООС) и рук персонала, в том числе медицинских организаций, как факторов распространения возбудителей инфекционных болезней. Согласно действующим нормативным документам основными направлениями микробиологического мониторинга являются санитарно-бактериологические исследования микробной обсемененности ООС^{1 2} и санитарно-вирусологические исследования³.

Несмотря на это, приоритет микробиологического мониторинга смещен в сторону определения и идентификации, прежде всего, патогенов бактериальной природы. Такой подход не учитывает современную тенденцию эпидемического процесса, характеризующуюся сменой ведущих возбудителей, со значительным увеличением этиологической роли агентов вирусов природы и не позволяет в полной мере установить причинно-следственные связи при расследовании вспышек инфекционных заболеваний [1].

Так, в частности, оценка вспышечной заболеваемости острыми кишечными инфекциями (ОКИ) свидетельствует о значительной роли в этиологии рота- и норовирусов [2]. В Государственном докладе «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации в 2021 году» отмечено, что в медицинских организациях в 2021 году помимо SARS-CoV-2 формировались вспышки, связанные с рота-, норо- и энетровирусами⁴.

В условиях пандемии COVID-19 сложилась особая необходимость проведения вирусологических исследований смывов с ООС и средств индивидуальной защиты (СИЗ) персонала в специализированных медицинских организациях (МО) стационарного типа – инфекционных госпиталях для лечения больных COVID-19. В учреждения данного типа формируется искусственно созданная закрытая экосистема, в которой отмечается одновременная циркуляция вирусов и бактерий с антимикробной резистентностью [3–6]. Это требует расширения номенклатуры исследований обсемененности ООС дополнительными вирусологическими исследованиями.

Регламентированная раздельность процедур отбора проб смывов с ОСС на бактериологические и вирусологические исследования не позволяет проводить совместную оценку вирусно-бактериальной контаминации в рамках микробиологического мониторинга. Страдает объективность оценки микробной контаминации за счет невозможности сопоставления результатов бактериологических и вирусологических исследований разных наблюдений [7–9]. Также не учитывается специфика взаимодействия вирусных и бактериальных популяций при их смешанной циркуляции, сопровождающаяся более длительным сохранением вирусов в бактериальных биопленках [10].

Создается необходимость в разработке и внедрении современного метода по одномоментной оценке, вирусно-бактериальной контаминации с целью установления роли ООС в эпидемиологической цепочке передачи возбудителей инфекционных болезней и разработке целенаправленных профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Цель исследования: провести сравнительный анализ методов отбора проб смывов с объектов внешней среды для оценки вирусно-бактериальной контаминации.

Материалы и методы. Исследование проведено в 2022 году на базе Екатеринбургского научно-исследовательского института вирусных инфекций Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор”» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (в настоящее время – Федеральное бюджетное учреждение науки «Федеральный научно-исследовательский институт вирусных инфекций “Виром”» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, приказ Роспотребнадзора № 599 от 11.11.2022), Федерального бюджетного учреждения здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области» и одного из учреждений здравоохранения Свердловской области, где был развернут инфекционный госпиталь для лечения больных COVID-19.

Отбор проб смывов с ООС и СИЗ персонала на наличие генетического материала SARS-CoV-2 и условно-патогенной микрофлоры (УПМ) проводили в соответствии с запатентованной авторами «Схемой отбора проб смывов с объектов внешней среды для одновременной оценки вирусно-бактериальной контаминации» (патент на промышленный образец № 132971 от 05.09.2022).

Смывы отбирали одновременно двумя стерильными тампонами в течение 3 суток через каждые 4 часа по 20 унифицированным точкам отбора (рисунок). Точки отбора были сгруппированы в 3 блока: СИЗ персонала (наружная поверхность перчаток врача, медицинской сестры, уборщика служебных помещений; наружная поверхность комбинезона врача, медицинской сестры, уборщика служебных помещений), пациенты (манипуляционный столик у постели больного, поручни и рычаги реанимационной кровати, наружная поверхность шприцевого дозатора, наружная поверхность аппарата ИВЛ), общебольничные точки (наружная поверхность электроотсоса, винты кислородной разводки, выключатели электроосвещения, ручки дверей, дозаторы для жидкого мыла/кожного антисептика, рабочее место врача). Всего было отобрано 343 пробы смывов, по 17–18 проб с каждой точки отбора.

Перед началом отбора проводилась подготовка пробирки с зонд-тампоном и средой для вирусов (СТ) и пробирки с зонд-тампоном и пептонной водой (ЗТ). Процедура взятия смыва осуществлялась в соответствии с запатентованной «Схемой отбора проб смывов с объектов внешней среды для одновременной оценки вирусно-бактериальной контаминации». После окончания отбора смывов зонд-тампоны опускали обратно в пробирки, которые устанавливали в штатив. В дальнейшем проба направлялась на микробиологические исследования для выделения УПМ. При выделении УПМ выделенные штаммы исследовались фенотипически и генотипически. Генетический материал вирусов в пробах определялся методом полимеразной цепной реакции. При обнаружении генетического материала вирусов проводили генотипирование.

Смывы брались одновременно с запланированных поверхностей путем легкого надавливания тампонами по поверхности. Перемещение тампонов по поверхности осуществлялось в двух перпендикулярных направлениях. При контроле мелких предметов смывы забирались с поверхности всего предмета, при контроле предметов с большей поверхности – из нескольких мест с общей площадью не менее 100 см². Смывы с рук брали в следующем порядке: протирали тампонами поверхности перчаток обеих рук, проводя не менее 5 раз по каждой тыльной, ладонной поверхностей кистей, больших пальцев и межпальцевых промежутков.

В настоящем исследовании после процедуры взятия смыва для обнаружения РНК SARS-CoV-2 тампон погружали в стерильные одноразовые пробирки, наполненные 2 мл транспортной среды для вирусов (ООО «Полигем»), для определения условно-патогенных бактерий – стерильные стеклянные пробирки с пептонной водой.

Хранение, подготовка проб к транспортированию, транспортировка и выявление РНК SARS-CoV-2 в пробах проводились в соответствии с МР 3.1.0196–20⁵, МУ 4.2.2942–11⁶ и инструкцией к тест-системам методом ПЦР в реальном времени с применением тест-системы АмплиСенс® Cov-Bat-FL. Для выделения нуклеиновых кислот из исследуемых проб использовали набор «РИБО-преп», проведения обратной транскрипции применяли набор «Реверта-L» (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва).

Изучение фенотипических свойств циркулирующей микрофлоры проводилось бактериологическим методом с подтверждением чистоты культуры, постановкой биохимических рядов. Оценка антибиотикорезистентности выделенных штаммов проводилась с помощью автоматического бактериологического анализатора VITEK® 2 Compact (bioMerieux SA, Франция) и классическим полуколичественным диско-диффузионным методом.

Объектом сравнения частоты выделения УПМ и генетического материала вируса SARS-CoV-2 при использовании стандартных (раздельных) методов отбора материала с объектов внешней среды послужили данные еженедельного отчета № 1364 «Мониторинг нарушения санитарного законодательства в медицинских организациях», представленного Управлениями Роспотребнадзора по субъектам Уральского Федерального округа (УФО) за 43 неделю 2021 года в системе оперативного обмена данных report.gsen.ru, что по времени соответствовало периоду проведения исследования.

Патентный поиск осуществлялся путем введения поисковых запросов по ключевым словам: смывы, отбор смывов, контаминация объектов, вирусно-бактериальная контаминация в базах данных «Патентные документы РФ» и «Российские промышленные образцы» Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный институт промышленной собственности» (https://fips.ru/iiss/). Глубина поиска составила 22 года (2000–2022 гг.).

В исследовании применяли молекулярно-генетические, бактериологический и статистический методы. Для анализа полученных данных применяли общепринятые статистические приемы. Данные представлены в виде абсолютных и относительных величин (%).

Статистическую значимость различий оценивали по точечному критерию Фишера (φ). Различия считали достоверными при p ≤ 0,05. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office 2010, онлайн-ресурса https://medstatistic.ru/, ПС Statistica 10.

Результаты. В ранее проведенном авторами исследовании была изучена вирусно-бактериальная контаминация объектов больничной среды инфекционного госпиталя для лечения больных, инфицированных SARS-CoV-2, и практически отработан метод отбора проб смывов с объектов внешней среды для одновременной оценки вирусно-бактериальной контаминации (патент на промышленный образец № 132971 от 05.09.2022 «Схема отбора проб смывов с объектов внешней среды для одновременной оценки вирусно-бактериальной контаминации») [11]. Настоящее исследование является логическим продолжением исследования по возможности совместной оценки вирусно-бактериальной контаминации в рамках микробиологического мониторинга.

Всего отобрано и исследовано 343 пробы смывов с ООС и СИЗ персонала, из них 68 нестандартных, в том числе 38 – РНК SARS-CoV-2 (11,1 %), 38 – УПМ (11,1 %).

Выделенный с поверхностей SARS-CoV-2 относился к геноварианту B.1.617.1 DELTA, который имел наибольшее распространение в период проведения исследования.

В процессе исследования нестандартных проб УПМ выделено 42 штамма бактерий: Enterococcus faecalis (16 штаммов, 38,1 %), Klebsiella pneumoniaе (9 штаммов, 21,4 %), Escherichia coli (7 штаммов, 16,7 %, Enterococcus faecium (3 штамма, 7,1 %), Staphylococcus aureus (3 штамма, 7,1 %), Pseudomonas aeruginosa (2 штамма, 4,9 %) и Pantoea agglomerans (2 штамма, 4,9 %).

Установлено 11 вариантов вирусно-бактериальных ассоциаций, спектр сочетания которых был крайне разнообразен: SARS-CoV-2 + E. faecalis (27,3 %), SARS-CoV-2 + K. pneumoniaе (18,2 %), SARSCoV-2 + E. coli (9,1 %), SARS-CoV-2 + P. aeruginosa (9,1 %), P. agglomerans + E. faecalis (9,1 %), E. coli + E. faecalis (9,1 %), K. pneumoniaе + E. faecalis (9,1 %), K. pneumoniaе + E. coli (9,1 %). В роли ассоцианта в большинстве случаев (63,6 %) выступал SARS-CoV-2, среди бактериальной микрофлоры лидировали E. faecalis (54,5 %) и K. pneumoniaе (36,4 %).

Профиль антибиотикорезистентности всех выделенных штаммов УПМ характеризовался устойчивостью к пенициллинам (40,5 %), фторхинолонам и тетрациклинам (по 33,3 %) и цефалоспоринам (26,2 %).

Штаммы E. faecalis были резистентны к макролидам (100,0 %) и тетрациклинам (75,0 %), в меньшей степени к фторхинолонам – 18,8 %. Все штаммы E. faecium были устойчивы к макролидам, треть была резистентна к нитрофурантоину.

Треть штаммов S. aureus была устойчива к пенициллинам и макролидам (по 33,3 %). Один выделенный штамм S. aureus имел фенотип MLSB, обуславливающий перекрестную устойчивость ко всем макролидам, линкозамидам и стрептограминам В.

Все выделенные штаммы K. pneumoniaе (100 %) были устойчивы к пенициллинам, цефалоспоринам, макролидам и сульфаметоксазол/триметоприму, в 66,7 % – к фторхинолонам, аминогликозидам, нитрофурантоинам, в 22,2 % – к карбапенемам, тетрациклинам, фосфомицину. Бета-лактамазу расширенного спектра действия (ESBL) продуцировали 7 (77,8 %) из 9 выделенных штаммов K. pneumoniaе.

Все выделенные штаммы E. coli проявили резистентность к пенициллинам (100,0 %), 71,4 % – к фторхинолонам. В меньшей степени устойчивость E. coli проявлялась к цефалоспоринам – 28,6 %, аминогликозидам и фосфомицину – по 14,3 %. Бета-лактамазу расширенного спектра действия (ESBL) продуцировали 2 (28,6 %) из 7 выделенных штаммов E. coli.

Штаммы P. aeruginosa были резистентны к фосфомицину (100,0 %) и пенициллинам (50,0 %), штаммы P. agglomerans – к тетрациклинам (100,0 %) и карбапенемам (50,0 %).

Нами проведено сопоставление результатов, полученных в ходе исследуемого отбора смывов для определения вирусно-бактериальной контаминации с результатами регламентированного отбора проб, который проводился в рамках еженедельного мониторинга вирусно-бактериальной контаминации ООС инфекционный госпиталей субъектов Уральского федерального округа (УФО) в период, соответствующий периоду проведения исследования (43 неделя 2021 г.).

Всего в инфекционных госпиталях УФО было отобрано и исследовано 709 пробы смывов на SARS-CoV-2 (нестандартных не выявлено) и 1021 проб на УПМ (из них 9 нестандартных, 0,9 %). Всего было выделено 10 штаммов бактерий, из них: Staphylococcus spp. (3 штамма, 30,0 %), E. coli (3 штаммов, 30,0 %), Klebsiella spp. (1 штамм, 10,0 %), Acinetobacter spp. (1 штамма, 10,0 %), P. aeruginosa (2 штамма, 20,0 %).

Сопоставление результатов исследования смывов, отобранных исследуемым методом, с результатами отбора регламентированным методом указывало на существенное различие в доле нестандартных находок SARS-CoV-2 – в 11,1, УПМ – 12,3 раза (табл. 1).

Спектр выделенных штаммов УПМ существенно не различался в зависимости от метода отбора и был представлен Enterobacter spp., Klebsiella spp., Escherichia coli, Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. (табл. 2). Однако частота выделения имела различия. Так, при регламентированном методе отбора в структуре находок преобладали Staphylococcus spp. и Escherichia coli (по 30,0 %), Pseudomonas aeruginosa (20,0 %), в том время как при одномоментном методе отбора лидировали Enterobacter spp. (45,2 %), Klebsiella spp. (21,4 %) и Escherichia coli (16,7 %).

Обсуждение. Необходимость совместной оценки уровня вирусной и бактериальной нагрузки в учреждениях различного типа приобрела особое значение в условиях пандемии COVID-19. Проведен широкий спектр исследований по изолированной оценке контаминации объектов больничной среды вирусом SARS-CoV-2 и представителями УПМ [12–15]. В Китае доля смывов с ОСС, отобранных в помещениях «красной зоны» инфекционных госпиталей для лечения больных COVID-19, содержащих РНК SARS-CoV-2, достигала 56,7 % [16–18]. В медицинских организациях г. Хабаровска уровень бактериальной контаминации ООС составил 4,7 %, были выделены P. aeruginosa, P. stutzeri, Acinetobacter baumannii, K. pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter cloacae, Pantoea, Enterococcus faecium, Staphylococcus haemolyticus, однако обнаружение вирусов (в т. ч. SARS-CoV-2) не проводилось [19].

Опубликованы результаты исследований и по совместной оценке вирусно-бактериальной контаминации. Так, в Испании отбор проб на SARS-CoV-2 осуществлялся методом смывов, а бактериальная нагрузка оценивалась путем прижатия чашек Петри с питательной средой к исследуемым поверхностям [20]. В США для совместной оценки вирусной (SARSCoV-2) и бактериальной нагрузки поверхностей инфекционного госпиталя для лечения больных и подозрительных на COVID-19 использовали синтетические тампоны с двойным наконечником, которые погружали в пробирку с этиловым спиртом. Однако применение этилового спирта вместо транспортной среды существенно ограничивало использование данного метода отбора совместно с классическими бактериологическими методами [21]. Исследование, проведенное в Англии, совмещало в себе изучение контаминации объектов больничной среды РНК SARS-CoV-2 с бактериями, однако в ходе него не проводили секвенирование и родовидовую характеристику выделенных бактерий [5]. Опубликованы данные и о применении двойных зондов для взятия смывов с рук для изучения влияния техники гигиены рук на микробном кожи [22].

В результате патентного поиска в базах данных «Патентные документы РФ» и «Российские промышленные образцы» Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный институт промышленной собственности» документов на методику одномоментного использования двух тупферов для отбора смывов с объектов внешней среды для совместной оценки контаминации объектов вирусами и бактериями нами не найдено.

Заключение. Таким образом, при сравнительном анализе исследуемого и регламентированного методов отбора проб установлено:

1. Отбор смывов с объектов внешней среды для одновременной оценки вирусно-бактериальной контаминации показал высокую эффективность в обнаружении нестандартных находок SARS-CoV-2 и УПМ (до 12,3 раза).

2. Исследуемый метод отвечает современным требования и обеспечивает возможность проведения объективной оценки уровня вирусно-бактериальной контаминации ООС и рук персонала, что позволяет оптимизировать проведение микробиологического мониторинга с учетом текущей эпидемиологической ситуации, проводить одновременную оценку контаминации объектов внешней среды бактериями и вирусами, целенаправленно проводить дезинфекционные мероприятия.

3. Данный подход может быть применен при проведении лабораторных исследований в рамках государственного и производственного контроля в учреждениях различных профилей (медицинских, пищевых, детских и пр.).