Результаты исследований генотоксических эффектов диоксинов в зависимости от полиморфизмов генов детоксикации ксенобиотиков и стажа работы пожарных

Введение. Трудовая деятельность пожарных связана с высоким риском для здоровья и жизни, что требует для этого контингента особенного правового статуса, более широких льгот и высоких социальных гарантий, чем в отношении работников, не подвергающихся угрозе жизни при выполнении профессиональных задач.

Нормативные акты, регулирующие контроль за состоянием здоровья пожарных, закреплены в ст. 4 Федерального закона от 28 марта 1998 г. № 52-ФЗ¹и не отражают влияние профессиональных вредных факторов пожаротушения.

Несовершенство правовой базы по охране здоровья пожарных приводит к тому, что профилактические осмотры не дают возможности мониторинга по выявлению хронических интоксикаций токсичными продуктами горения. Их оценивают только при госпитализации по поводу острых отравлений, которые регистрируются как несчастные случаи на производстве. В настоящее время в системе МЧС России гигиенические исследования по оценке условий труда пожарных при выполнении профессиональных задач проводятся редко, а длительное воздействие токсичных продуктов горения на организм пожарных не регистрируется².

Во время пожаротушения пожарные подвергаются влиянию комплекса факторов различной природы, ведущее место среди которых занимает химический фактор. Это объясняется непрогнозируемым токсическим эффектом от воздействия широкого спектра продуктов горения, качественные и количественные характеристики которых трудно определимы и, в первую очередь, зависят от используемых при строительстве полимерных и полимерсодержащих материалов. Согласно литературным данным, при качественном анализе продуктов горения на пожаре выделяется более 100 химических соединений, часть которых обладает эффектом суммации [1][2]. Необходимо отметить, что существенную опасность представляют низкотемпературные пожары, что обусловлено образованием в продуктах горения диоксинов и диоксиноподобных соединений.

Данные соединения обладают высокой химической устойчивостью и выраженным кумулятивным эффектом, длительное время сохраняются в организме человека и вызывают отсроченные эффекты [3–7]. Самым опасным, по отношению к которому и применяется термин «диоксин», является 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксин (ТХДД) [8]. Период полувыведения для ТХДД составляет примерно 7 лет [9–11].

Понятие «диоксины» включает в себя две большие группы полихлорированных дибензодиоксинов (ПХДД) и полихлорированных дибензофуранов (ПХДФ) с различным числом и расположением атомов хлора. ПХДД и ПХДФ обычно встречаются в смесях и представляют собой группу из 210 трициклических, хлорсодержащих ароматических химических веществ (75 конгенеров ПХДД и 135 конгенеров ПХДФ). Мониторингу подлежат только 17 из них, которые отличает 2,3,7,8-положение атомов хлора и очень высокая токсичность [12–15].

Образование диоксинов связано с низкотемпературными процессами горения полимерных и полимерсодержащих хлорированных соединений в диапазоне температур от 200 до 900 °C, а также с побочными технологическими процессами различных отраслей промышленности. Основным отличием от других профессий является то, что пожарные подвергаются воздействию диоксинов в составе сложного комплекса токсичных веществ [16]. Существует много путей поступления диоксинов в организм человека, одним из которых является поступление через органы дыхания, характерное для профессиональной деятельности пожарных [17][18]. Наибольший вклад в поступление диоксинов в организм людей связан с потреблением продуктов питания (более 90 % содержания диоксинов в организме), прямое вдыхание составляет незначительную долю совокупного воздействия диоксинов и составляет менее 5 % поступления с пищей. Однако в некоторых чрезвычайных ситуациях (например, на территориях, расположенных вблизи источников загрязнения) доля воздействия диоксинов за счет вдыхания может приближаться к значениям, соответствующим поглощению их с пищей³. Поступление с питьевой водой является незначительным. По-видимому, это можно объяснить молекулярной структурой диоксинов и устойчивостью их к разложению, а также способностью к аккумуляции в жиросодержащих тканях живых организмов и перемещению по пищевой цепи [12][19].

По результатам ранее проведенного исследования [7][20] нами были сделаны предположения, что высокие концентрации диоксинов в воздухе на всех этапах ликвидации пожаров и высокие концентрации диоксинов в липидах крови пожарных в зависимости от стажа работы позволяют говорить об ингаляционном пути поступления диоксинов как одном из основных для данной профессиональной группы. Кроме того, в зависимости от полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков и концентрации диоксинов в липидах крови, были выделены генотипы 6 кандидатных генов, при которых у пожарных были выявлены статистически значимые изменения концентрации диоксинов в крови.

Дальнейшее исследование было связано с изучением кариопатологических проявлений генотоксических эффектов диоксинов. В последние годы внимание исследователей привлекает проблема медицинской значимости генотоксических поражений генома, что особенно актуально для пожарных, подвергающихся ежедневному воздействию генотоксикантов с высокими кумуляционными свойствами.

Цель исследования – изучение кариопатологических проявлений генотоксических эффектов диоксинов у пожарных в зависимости от стажа профессиональной деятельности и различных полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков.

Материалы и методы. Оценку цитогенетического статуса пожарных проводили с помощью расширенного микроядерного теста буккального эпителия. У 252 пожарных (основная группа) и 86 спасателей и лиц других профессий (контрольная группа) после тщательного прополаскивания полости рта с внутренней поверхности щеки собирали клетки слизистой оболочки и наносили их на предварительно обезжиренное предметное стекло. На каждого обследуемого готовили 2 мазка буккального эпителия и анализировали две тысячи (2000) неповрежденных клеток [21]. Препараты фиксировали с помощью стандартной методики Карнуа (этанол и ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1). Окраску хроматина проводили с помощью ацетоорсеина, а цитоплазму контрастировали с помощью светлого зеленого. Анализ показателей кариопатологических изменений проводили микроскопированием готовых препаратов с применением микроскопа Bresser Advance ICD (Германия), оснащенного видеокамерой с увеличением ×400–600, определяли частоту встречаемости клеток с микроядрами, протрузиями, ядерными мостами, атипичных клеток, патологических митозов и других кариопатологических изменений. Пролиферативные нарушения оценивали по частоте дву- и многоядерных клеток. Показатели ранней деструкции ядер определяли по частоте встречаемости клеток с вакуолизированными ядрами, конденсацией хроматина и началом кариолизиса. Маркерами поздней деструкции ядра являлись наличие в клетках выраженного кариорексиса, кариопикноза и полного кариолизиса. Оценку риска возникновения цитогенетических аномалий в эпителиоцитах проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека»⁴ и выражали в виде индекса накопления цитогенетических нарушений (Iac – index of accumulation of cytogenetic damage), представленного произведением интегрального показателя цитогенетических нарушений (Ic – cytogenetic index) и интегрального показателя пролиферации (Ip – index of proliferation), деленным на апоптотический индекс (Iapop – apoptotic index):

Iac = (Ic × Ip/Iapop) × 100, где

Ic – сумма клеток с микроядрами и протрузиями; Ip – сумма многоядерных клеток; Iapop – апоптотический индекс, представленный суммой клеток с кариорексисом, кариопикнозом и кариолизисом.

Рассчитанный Iac позволяет отнести обследованных к какой-либо из групп риска в зависимости от величины показателей. Считается, что при Iac < 2 – низкий риск. Умеренный риск характеризуется значениями Iac от 2 до 4. Для Iac более 4 характерен высокий уровень риска накопления цитогенетических нарушений [22][23].

Для оценки взаимосвязи степени кариопатологических изменений и активности ферментов детоксикации ксенобиотиков из 120 вариантов комбинаций генотипов 6 генов-кандидатов выбрали 2 крайних варианта сочетания генов, при которых у сотрудников ФПС МЧС России были выявлены статистически значимые цитогенетические изменения в клетках буккального эпителия. В первой обобщенной группе пожарных – (22,1 ± 1,4) % оказалось сочетание 6 генотипов (EPHX1 Tyr/ Tyr, CYP1A1 A/A, GSTT1 I/I, GSTM1 I/I, GSTP1 A/A, GSTP1 C/C), ассоциированных с высокой активностью ферментов детоксикации ксенобиотиков 1-й и 2-й фазы биотрансформации. Вторую обобщенную группу пожарных – (14,5 ± 1,2) % составили лица, имеющие сочетание других 6 генотипов (EPHX1 Tyr/His, CYP1A1 A/G, GSTT1 I/D, GSTM1 I/D, GSTP1 A/G, GSTP1 T/T).

Исследование одобрено на заседании Локального этического комитета (протокол № 2018/2.2 от 21.12.2018). От участников исследования получено добровольное информированное согласие. Исследования проводились в период с 2019 по 2022 г.

Результаты. Для оценки генотоксического эффекта диоксинов провели анализ клеток буккального эпителия. Определяли цитогенетические показатели, представленные микроядрами, протрузиями ядер, атипичными формами ядер, а также межъядерными мостами; оценивали показатели пролиферации клеток, представленные дву- и многоядерными клетками, клетками со сдвоенными ядрами, отмечали раннюю стадию деструкции ядер по интерпретации конденсации хроматина, перинуклеарных вакуолей, вакуолизации ядер, а также выявляли признаки поздней стадии деструкции ядер, характеризующиеся кариорексисом, кариопикнозом, полным кариолизисом. Результаты исследований показателей кариопатологических изменений в зависимости от стажа работы и концентрации диоксинов в липидах крови представлены в табл. 1 и 2.

Далее была проанализирована частота кариопатологических изменений у пожарных, участвующих в пожаротушении, в зависимости от полиморфизма генов детоксикации ксенобиотиков первой и второй фазы биотрансформации (табл. 3–7).

По результатам оценки полиморфизма генов, ассоциированных с высокой активностью ферментов детоксикации ксенобиотиков 1-й и 2-й фазы биотрансформации, обследуемые были разделены на две группы: первую группу составили лица с сочетанием 6 генотипов (EPHX1 Tyr/Tyr, CYP1A1 A/A, GSTT1 I/I, GSTM1 I/I, GSTP1 A/A, GSTP1 C/C), ассоциированных с высокой активностью ферментов (22,1 ± 1,4 %); во вторую группу вошли обследуемые (14,5 ± 1,2 %) c сочетанием других 6 генотипов (EPHX1 Tyr/His, CYP1A1 A/G, GSTT1 I/D, GSTM1 I/D, GSTP1 A/G, GSTP1 T/T), отличающихся достоверно более высокой концентрацией диоксинов в крови. В группах сравнения рассчитан индекс накопления цитогенетических нарушений. Результаты представлены в табл. 8.

Обсуждение. В настоящее время большое количество работ, раскрывающих влияние токсичных продуктов горения на организм человека, посвящено профессиональной деятельности пожарных как категории лиц, наиболее часто сталкивающихся с этими продуктами в процессе выполнения профессиональных задач по пожаротушению. Однако в данных работах анализ генотоксических эффектов токсичных продуктов горения с помощью цитогенетических методик не проводился [1][3][4][9–11][15–18]. В работах, посвященных цитогенетическому мониторингу, оценивается цитогенетический статус разных групп населения в связи с загрязнением окружающей среды, который может служить биомаркером уровня загрязнения среды генотоксикантами, дает возможность выявления зон риска, позволяет определять неблагоприятные факторы, воздействующие на человека, а также высокий уровень клеток с цитогенетическими повреждениями на ранних стадиях патологии [6][21][22][24].

Полученные нами результаты определяют зависимость кариопатологических изменений от стажа профессиональной деятельности, связанной с пожаротушением. Показатели, представленные в табл. 1, свидетельствуют, что у пожарных, подвергающихся воздействию комплекса генотоксических факторов, поступающих в окружающую среду в виде токсичных продуктов горения при пожарах, отмечается увеличение частоты кариопатологических аномалий в клетках буккального эпителия по сравнению с контрольной группой. В зависимости от стажа частота встречаемости клеток с микроядрами и с протрузиями в 2–3 раза выше, чем в контрольной группе. Ядра с атипичной формой, причина возникновения которых заключается в нарушениях строения генома (в частности, дупликаций его участков) [22], также чаще определяются в группах пожарных со стажем более года. Также у пожарных достоверно чаще (p < 0,001) регистрировались признаки патологической пролиферации клеток, характеризующиеся увеличением частоты встречаемости двуядерных и трехъядерных клеток, клеток, содержащих сдвоенные ядра, что, в свою очередь, свидетельствует об усилении процессов компенсаторной пролиферации новых клеток [21]. Показатели ранней деструкции ядер, представленные образованием перинуклеарных вакуолей, в 4 раза выше у пожарных со стажем больше 5 лет в сравнении с группой контроля. В этой группе в 4 раза чаще наблюдались и случаи кариорексиса. В то же время у пожарных увеличено количество клеток с кариопикнозом и кариорексисом по сравнению с контрольной группой. При этом частота встречаемости этих клеток уменьшается с увеличением стажа. В группе пожарных с большим стажем отмечались более низкие значения конденсации хроматина, что связано с увеличением пластичности буккального эпителия – повреждение генома связано с репарационными процессами, что требует активизации считывания генетической информации [8].

В работах, посвященных воздействию диоксинов на организм пожарных, основное внимание уделяется концентрациям диоксинов в липидах крови и коррелирующими с ними изменениями системы биотрансформации ксенобиотиков, но проводимый анализ касается в основном одной уникальной высокоэкспонированной диоксинами когорты (пожарные, участвовавшие в ликвидации пожара в 1992 году на кабельном заводе в городе Шелехове), и не оценивается цитогенетический статус пожарных [11][15–18]. В представленном нами исследовании определена зависимость генотоксических эффектов диоксинов от их концентрации в организме. Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что у пожарных отмечается увеличение частоты кариопатологических аномалий в клетках буккального эпителия в зависимости от концентрации диоксинов в липидах крови и по сравнению с контрольной группой. У пожарных с высокой концентрацией диоксинов в липидах крови частота встречаемости клеток с микроядрами и с протрузиями в 2–3 раза выше, чем частота этих цитогенетических нарушений в контрольной группе (р ≤ 0,001). Частота встречаемости атипичных ядер выше в группах пожарных с высокой концентрацией диоксинов липидов крови, что демонстрирует увеличение генетических аномалий. В то же время у пожарных с большей концентрацией диоксинов в липидах крови с высокой достоверностью чаще определялись признаки пролиферативных нарушений. Показатели ранней деструкции ядер, представленные образованием перинуклеарных вакуолей, в 4 раза выше у пожарных с концентрацией диоксинов выше 350 пг/г липидов, чем у лиц группы контроля. Также в этой группе в 4 раза чаще наблюдался и кариорексис. Повышение частоты образования перинуклеарных вакуолей и вакуолизация ядер у пожарных с высокой концентрацией диоксинов в липидах крови свидетельствует о наличии признаков некроза. В то же время у пожарных увеличено количество клеток с кариопикнозом и кариорексисом, что свидетельствует о нарастании апоптоза. Вероятно, что при воздействии токсичных продуктов горения, в том числе диоксинов, происходит повышение случаев апоптоза, что приводит к повышению уровня некротических процессов в клетках буккального эпителия [6].

Анализ зависимости концентраций диоксинов в липидах крови пожарных от различных полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков был представлен в наших предыдущих статьях [7][20]. Также подавляющее большинство работ, посвященных хроническому воздействию диоксинов, направлено на изучение взаимосвязи уровня диоксинов в организме человека с различными полиморфными вариантами генов детоксикации ксенобиотиков [10][11][19]. В то же время в этих работах не рассматривается взаимосвязь активности ферментов детоксикации ксенобиотиков и кариопатологических изменений. Вместе с тем в исследовании по изучению начальных проявлений интоксикации у клинически здорового населения загрязненных диоксинами территорий Вьетнама анализ реакций клеточных и субклеточных структур в организме человека на равные по дозовой экспозиции воздействия диоксинами свидетельствует, что их разнообразие определяется вариабельностью индивидуальной чувствительности, обусловленной спецификой генотипа, пола и возраста [24].

Проведенный в представленном исследовании анализ кариопатологических изменений в клетках буккального эпителия сотрудников ФПС МЧС России в зависимости от различных полиморфных вариантов гена, кодирующего эпоксидгидролазу, важнейшего фермента биотрансформации, преобразующего эпоксиды из деградированных ароматических соединений в трансдигидродиолы, показал, что носители генотипа Tyr/Tyr, ассоциированного с высокой активностью фермента, отличаются достоверно более низкой частотой встречаемости кариопатологических изменений (табл. 3). Статистически достоверно повышенные уровни цитогенетических нарушений в группах с полиморфизмами гена EPHX1 с низкой активностью эпоксидгидролазы свидетельствуют о недостаточности детоксикационной функции фермента, кодируемого при этом полиморфизме, что способствует кумуляции диоксинов и увеличению их генотоксического эффекта на клеточные структуры организма сотрудников ФПС МЧС России при выполнении задач по пожаротушению. Также у пожарных, носителей полиморфных вариантов Tyr/Tyr, частота встречаемости клеток с пролиферативными нарушениями статистически значимо ниже, чем у носителей полиморфизмов, ассоциированных с низкой детоксикационной способностью фермента. Апоптотический индекс, наоборот, выше в группе носителей полиморфизма, связанного с высокой активностью фермента.

Анализ особенностей цитогенетических нарушений в клетках буккального эпителия сотрудников ФПС МЧС России при различных вариантах гена, кодирующего цитохром Р450 1A1, монооксигеназу печени, важнейшего фермента первой фазы детоксикации ксенобиотиков, показал, что носители генотипа A/A, ассоциированного с высокой активностью фермента, отличаются достоверно более низкой частотой встречаемости кариопатологических изменений (табл. 4). Статистически достоверно повышенные уровни цитогенетических нарушений в группах с полиморфизмами, ассоциированными с низкой активностью монооксигеназы, свидетельствуют о недостатке детоксикационной функции фермента при данном полиморфизме и увеличении генотоксического эффекта диоксинов на организм пожарных. Также у пожарных, носителей полиморфных вариантов A/A, частота встречаемости клеток с пролиферативными нарушениями статистически значимо ниже, чем у носителей полиморфизмов, ассоциированных с низкой детоксикационной способностью фермента. В то же время по оценке апоптотического индекса в группах с различными полиморфизмами гена CYP1A1 статистически достоверных различий выявлено не было.

Результаты оценки связи активности ферментов детоксикации ксенобиотиков второй фазы биотрансформации с уровнем цитогенетических нарушений при воздействии токсичных продуктов горения на организм пожарных при пожаротушении свидетельствуют, что при полиморфизмах, ассоциированных с высокой активностью фермента, определяется достоверно более низкая частота встречаемости кариопатологических изменений.

У носителей генотипа D/D гена GSTM1, кодирующего аминокислотную последовательность фермента мю-1 глутатион-S-трансферазы, отмечается более высокая частота цитогенетических и пролиферативных изменений клеток буккального эпителия, а также более низкий показатель индекса апоптоза (табл. 5).

Носители делеционного генотипа D/D гена GSTТ1, кодирующего аминокислотную последовательность фермента тета-1 глутатион-S-трансферазы, характеризовались достоверно белее высокими показателями частоты встречаемости цитогенетических и пролиферативных нарушений (табл. 6). При этом частота апоптотических изменений, наоборот, среди носителей гомозиготного генотипа D/D была ниже. В литературных источниках представлены сведения о частоте носителей генотипа D/D: в европеоидной популяции их определяется 15–30 %, в негроидной – около 25 %, а в монголоидной – до 58 %. В русской популяции европейской части России частота делеционного генотипа определяется примерно в 18 % случаев [25].

Носители аллеля А гена GSTP1, кодирующего аминокислотную последовательность фермента пи-1 глутатион-S-трансферазы, демонстрировали более низкую частоту встречаемости клеток с цитогенетическими и пролиферативными изменениями в сравнении с носителями гомозиготного генотипа G/G (табл. 7). У носителей аллеля А глутатион-S-трансфераза ассоциирована с большей детоксикационной активностью ксенобиотиков за счет связывания глутатиона с субстратами. Полиморфизм гена GSTP1 определяется заменой нуклеотида аденина (А) на гуанин (G), приводящей к замене аминокислоты в пептидной цепи молекулы фермента, и связана со снижением его активности, что приводит к повышению кумуляции токсикантов в организме и, в свою очередь, увеличению частоты встречаемости клеток с кариопатологией.

Вышеизложенные результаты подтверждаются данными, представленными в табл. 8, свидетельствующими, что у лиц первой обобщенной группы индекс накопления цитогенетических нарушений Iac достоверно ниже, чем у лиц второй обобщенной группы, генотипы генов которых ассоциированы с низкой детоксикационной активностью.

Заключение. Таким образом, у пожарных в зависимости от стажа работы и концентрации диоксинов в липидах крови отмечено увеличение частоты кариопатологических аномалий в клетках буккального эпителия в сравнении с контрольной группой. Анализ взаимосвязи различных полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков, диоксинов в липидах крови пожарных и индекса накопления цитогенетических нарушений показал, что лица с сочетанием 6 генотипов (EPHX1 Tyr/ Tyr, CYP1A1 A/A, GSTT1 I/I, GSTM1 I/I, GSTP1 A/A, GSTP1 C/C) характеризовались наличием ферментов детоксикации ксенобиотиков с высокой активностью и большей устойчивостью к возникновению кариопатологических изменений под воздействием генотоксикантов. Полученные в результате проведенного исследования уровни цитогенетических нарушений свидетельствуют о неблагоприятном воздействии токсичных продуктов горения (в т. ч. диоксинов), которому подвергаются сотрудники при выполнении задач по пожаротушению.