Молекулярно-генетический анализ возбудителей бактериальных пневмоний, ассоциированных с COVID-19, в стационарах г. Ростова-на-Дону

Введение. Присоединение бактериальной суперинфекции на фоне COVID-19 является одной из основных причин, приводящих к более тяжелому течению болезни у пациента, повышению риска неблагоприятного исхода заболевания и, как следствие, увеличению времени пребывания в стационаре [1–6]. Так, например, Acinetobacter baumannii, резистентный к карбопенемам, явился этиологическим фактором продолжительной вспышки внутрибольничной инфекции в Нью-Джерси, что, по мнению исследователей, было связано с его способностью длительно сохраняться на различных поверхностях и руках медицинских работников [7]. Не меньшую проблему представляет собой синегнойная палочка – Pseudomonas aeruginosa, что особенно актуально ввиду приобретения ей множественной антибиотикорезистентности. По данным ряда авторов, P. aeruginosa является одним из возбудителей бактериальных пневмоний, ассоциированных с COVID-19 [7–10].

В связи с этим большое внимание исследователей уделяется изучению генетических маркеров, позволяющих выявлять клональные связи между различными изолятами возбудителей бактериальных коинфекций, что в свою очередь позволяет дифференцировать внутрибольничные и внебольничные случаи заражения [11].

Другим важным аспектом является увеличение удельного веса патогенов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, обусловленной конъюгативными плазмидами [12–14]. Согласно данным литературы именно такие плазмиды являются одной из причин формирования внутрибольничных штаммов, обеспечивая их селективное преимущество перед возбудителями внебольничных инфекций [15][16]. Причем особенно остро эта проблема актуализировалась в период пандемии COVID-19 из-за существенно возросшей нагрузки на стационары. В настоящее время благодаря современным молекулярно-генетическим методам, в частности высокопроизводительному полногеномному секвенированию, становится возможным обнаружение подобных генетических элементов и раскрытие механизмов множественной антибиотикоустойчивости [17][18].

Ранее нами показано, что особенностью внебольничных пневмоний у больных с лабораторно подтвержденным COVID-19 является более высокая частота микст-инфекций как вирусной, так и бактериальной этиологии, в том числе характеризующихся полирезистентностью к антибактериальным препаратам [19].

Цель настоящего исследования состояла в изучении генетического разнообразия и клональных связей A. baumannii и P. aeruginosa, выделенных от пациентов с новой коронавирусной инфекцией в г. Ростове-на-Дону.

Материалы и методы. В период 2–24 декабря 2020 г. в г. Ростове-на-Дону выполнено исследование 217 проб мокроты от больных с внебольничной пневмонией, находившихся в двух городских больницах г. Ростова-на-Дону, обозначенных как медицинские организации «А» и «Б». Критериями включения в исследование являлись возраст старше 18 лет, установленный диагноз внебольничной пневмонии (J 18.9) согласно Российским национальным рекомендациям по внебольничной пневмонии (2019) и информированное согласие пациента на участие в исследовании. Пациентов обследовали двукратно: при поступлении в стационар и через 6–10 дней после лечения в стационаре.

Для выявления микроорганизмов на объектах окружающей среды отбирали смывы в палатах и других помещениях в соответствии с МУК 4.2.2942–11 «Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях».

Проведен молекулярно-генетический анализ геномного разнообразия возбудителей внебольничных пневмоний, изучено пять штаммов P. aeruginosa и пять штаммов A. baumannii (табл. 1).

Полногеномное секвенирование проведено на секвенаторе MiSeq (Illumina, США). Для тримминга использовали алгоритм Trimmomatic [20]. Сборку геномов проводили с применением геномного ассемблера Spades [21]. В сравнительный анализ включены данные полногеномного секвенирования штаммов P. aeruginosa и A. baumannii, полученные из базы данных NCBI. Отбор SNP-маркеров проводили с помощью авторского программного обеспечения, написанного на языках Java и Python [22]. Кластерный анализ и построение дендрограммы проводили с использованием авторского программного обеспечения по методу UPGMA. Для визуализации построенной дендрограммы применена программа MEGA 5 [23].

С целью амплификации плазмид из суточных культур микроорганизмов готовили взвесь 10⁹ мк.кл./мл в жидкой среде LB, содержащей смесь антибиотиков (цефтриаксон 5 мкг/мл, хлорамфеникол 5 мкг/мл, цефотаксим 5 мкг/мл), и инкубировали при 37 °С 12 часов. После инкубации 1 мл каждой культуры переносили в пластиковые пробирки. Бактерии осаждали центрифугированием и проводили выделение ДНК с использованием набора реагентов «Рибо преп» (ООО «Амплисенс», г. Москва).

Результаты и обсуждение. В результате обследования 217 пациентов с диагнозом «внебольничная пневмония» в первый день поступления в стационар медицинских организаций «А» и «Б» наличие SARS-CoV-2 лабораторно подтверждено у 71 пациента (32,7 %). Установлено, что частота случаев ВП увеличивалась пропорционально возрасту пациентов. Так, 76,7 % случаев ВП зарегистрировано у лиц старше 50 лет, при этом наибольшее (32,5 %) число заболевших отмечено среди пациентов от 60 до 69 лет. По данным National Center for Health Statistics, у пожилых людей заболеваемость внебольничной пневмонией в два раза выше, чем у лиц молодого возраста, а сопутствующие заболевания, нередко с декомпенсацией, усложняют лечение больного и ухудшают прогноз заболевания [24]. В связи с этим особенно важно было определить спектр этиологических агентов, способных утяжелить течение внебольничной пневмонии, ассоциированной с COVID-19. В ходе проведенного бактериологического исследования мокроты от больных у 52,1 % (113 из 217) пациентов с внебольничной пневмонией были выявлены возбудители бактериальной и грибковой природы.

Следует отметить, что наиболее часто встречающийся этиологический агент внебольничных пневмоний Streptococcus pneumoniae не был обнаружен в данном исследовании, что может быть связано с высоким охватом населения Ростовской области вакцинацией от пневмококков. Наиболее частым этиологическим агентом ВП бактериальной природы являлись плазмокоагулирующие стафилококки (Staphylococcus aureus), которые обнаружены у 5,5 % пациентов. Были зарегистрированы случаи выделения представителей семейства Enterobacteriaceae, в том числе Escherichia coli (у 1,8 % пациентов) и Klebsiella pneumoniae (2,3 %), а также культур неферментирующих грамотрицательных бактерий (НГБО), преимущественно A. baumanii (2,3 %) и P. aeruginosa (1,4 %). В структуре изолированной микрофлоры превалировали грибы рода Candida, среди которых 71,4 % пришлось на долю C. albicans (рис. 1).

Регулярное использование инвазивных методов лечения у пациентов с SARS-CoV-2, применение в схеме лечения данной группы пациентов кортикостероидных препаратов увеличивает риск распространения внутрибольничной инфекции среди пациентов. В связи с вышеизложенным проведено повторное обследование пациентов через 6–10 дней после лечения в стационаре. В результате присоединение вторичной инфекции отмечено у 51,6 % пациентов. Из возбудителей бактериальной природы превалировали типичные представители нозокомиальных инфекций – неферментирующие грамотрицательные бактерии A. baumanii (у 8,0 % пациентов с вторичной инфекцией), P. aeruginosa (3,2 %) и K. pneumoniae (6,4 %), в том числе характеризующиеся полирезистентностью к антибактериальным препаратам.

В результате исследования смывов из ООС (палат, коридоров) изолированы устойчивые к широкому спектру антибактериальных препаратов культуры S. haemolyticus и A. baumanii.

Дальнейшая работа была направлена на анализ источника присоединения вторичной инфекции у пациентов с пневмонией, для этого отобраны штаммы A. baumanii и P. aeruginosa.

Молекулярно-генетический анализ штаммов P. aeruginosa

Проведен сравнительный анализ пяти геномов P. aeruginosa и составлен перечень SNP-маркеров для последующего анализа. По итогам этого этапа отобрано 41 898 SNP, расположенных в открытых рамках считывания.

Последующий анализ коллекции геномов P. aeruginosa, состоящей из пяти изолятов, выделенных в г. Ростове-на-Дону, и 53 штаммов из базы данных NCBI, позволил построить дендрограмму, отражающую филогенетические связи между изучаемыми штаммами (рис. 2). В ряде случаев прослеживается четкая географическая приуроченность отдельных групп штаммов. Так, например, штаммы, выделенные в Москве в 2019–2020 гг., попали в отдельный кластер, отличаясь от кластера штаммов из Нижнего Новгорода.

Штаммы P. aeruginosa, выделенные в г. Ростовена-Дону в 2020 г., распределились между четырьмя кластерами. Изоляты P. aeruginosa №№ 44712 и 45287, выделенные в медицинской организации «Б», попали в общий кластер, отличаясь друг от друга по 13 SNP. В совокупности с данными о времени пребывания пациента в стационаре (забор мазка проводился повторно на 10-й день госпитализации) это свидетельствует о внутрибольничном заражении единым клоном P. aeruginosa, циркулирующим в данном стационаре. Необходимо отметить, что отличие описанных штаммов от изолята P. aeruginosa № 45528, выделенного в этой же больнице, но при взятии биологического материала в день поступления в стационар, составило уже более 8 тысяч SNP, что подтверждает его принадлежность к другому клону и присоединение коинфекции, по-видимому, за счет развития условно-патогенной микрофлоры на фоне поражения респираторной системы вирусом SARS-CoV-2.

Подробный анализ полученных полногеномных последовательностей пяти штаммов P. aeruginosa позволил выявить последовательности конъюгативной плазмиды NC11MDR19 размером 19217 п.о., в которой обнаружены 35 генов, в том числе пять идентифицированы как гены множественной антибиотикоустойчивости и один ген – устойчивости к дезинфектантам (табл. 2). Весьма примечательно, что данная плазмида обнаружена в двух штаммах P. aeruginosa  № 44712 и 45287, выделенных от больных, госпитализированных в медицинскую организацию «Б», что также свидетельствует в пользу их общего внутрибольничного происхождения. Следует отметить, что в смывах из объектов окружающей среды данного стационара штаммы P. aeruginosa изолированы не были. Тем не менее результаты проведенных исследований подтверждают внутрибольничное распространение возбудителя нозокомиальной инфекции P. aeruginosa. В то же время два штамма P. aeruginosa, выделенные от пациентов стационара «А», отнесены к разным клонам, т. е. доказательств внутрибольничного заражения пациента, проходящего лечение в данной медицинской организации, нами не получено.

Молекулярно-генетический анализ штаммов A. baumannii

С целью изучения генетического разнообразия штаммов A. baumannii создана рабочая коллекция, в которую вошли пять геномов, полученных из биологического материала от больных, госпитализированных в медицинскую организацию «А», и 61 геном из базы данных NCBI. По итогам составлен перечень из 77 408 SNP, расположенных в открытых рамках считывания, что позволило построить дендрограмму, отражающую степень генетической связи между различными штаммами (рис. 3).

Анализ дендрограммы показал, что штаммы A. baumannii №№ 44116 и 44109 представляют собой один клон, отличаясь друг от друга на два SNP. При этом от наиболее генетически близкого им штамма AbCTX4, выделенного во Франции (2015 г.), их отличало уже 448 SNP. Учитывая, что данные штаммы были отобраны у пациентов на 10-й день госпитализации, это доказывает, что они представляют собой общий внутрибольничный клон, циркулирующий в медицинской организации «А».

Три штамма A. baumannii №№ 168, 39442 и 39924 образуют общий кластер, отличаясь между собой на 8-17 SNP. От штамма A. baumannii № CriePir87 их отличали 32 единичные нуклеотидные замены. Важно отметить, что два из этих штаммов – №№ 39442 и 39924 – были выделены от пациентов в момент поступления в стационар, в то время как штамм № 168 был выделен из смыва с объектов внешней среды. Сходные данные получены группой авторов при изучении штаммов A. baumannii из различных стационаров – были выявлены совпадающие PFGE-типы между клиническими изолятами и штаммами из окружающей среды [25].

Подробный биоинформационный анализ позволил выявить у двух штаммов A. baumannii №№ 44116 и 44109 конъюгативную плазмиду NC16MDR19 размером 11 194 п.о., несущую ген устойчивости к карбопенемам/пенициллинам. Учитывая, что подобные плазмиды не встречаются у природных штаммов, ее наличие в изучаемых изолятах подтверждает их внутрибольничное происхождение.

Заключение

Таким образом, в ходе проведенного исследования установлен спектр этиологических агентов бактериальной природы, вызывающих развитие вторичной инфекции на фоне COVID-19. По результатам полногеномного секвенирования 10 возбудителей пневмоний, выделенных от пациентов с новой коронавирусной инфекцией, выявлена клональность отдельных штаммов. Доказано внутрибольничное происхождение двух изолятов P. aeruginosa и двух – A. baumanii, в свою очередь анализ плазмидного состава подтвердил их внутрибольничное происхождение.

Присоединение вторичной бактериальной инфекции у пациентов, находящихся на лечении, может быть обусловлено разными сценариями, одним из которых является патологическое развитие доминирующей микрофлоры слизистых верхних дыхательных путей, обеспечивающей нормобиоценоз у здоровых людей, чему способствует назначение пациентам стероидов и ингибиторов провоспалительных цитокинов, а также эмпирическое применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия у пациентов с внебольничными пневмониями, в том числе ассоциированными с COVID-19. В то же время несоблюдение в должном объеме принципов противоэпидемического режима и инфекционной безопасности в медицинских организациях в отношении инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), также может служить причиной развития внутрибольничных инфекций у пациентов. Очевидно, что данная ситуация не уникальна, ИСМП являются одной из ведущих проблем здравоохранения. В свою очередь всестороннее изучение и обсуждение факторов регистрации ИСМП, условий, приводящих к их возникновению и распространению в медицинских организациях, в конечном итоге способствуют совершенствованию мероприятий в рамках обеспечения инфекционной безопасности в стационарах.