Особенности генетического полиморфизма генов GSTM1, GSTT1, GSTP1 у рабочих Нижнетагильского металлургического комбината с заболеваниями сердечно-сосудистой системы

Введение. В настоящее время остро ощущается проблема роста преждевременной смертности трудоспособного населения, а также увеличения уровня трудопотерь, вызванных развитием профессиональных заболеваний. На формирование данных патологий влияют не только условия труда рабочих (тяжесть трудового процесса, свойства и дозы экспонированных аэрозолей и т. д.), но и генетические (индивидуальные) особенности организма. Поэтому важной задачей современной медицины труда является оценка роли не только экзогенных факторов (условий труда), но и эндогенных (генетических) факторов, способствующих развитию профессиональных патологий у работающего населения, с целью выявления потенциальных групп риска и своевременного проведения профилактико-диагностических мероприятий [1][2].

В воздухе рабочей зоны на металлургических предприятиях встречается большое количество ксенобиотиков: марганец, железо, ванадий, хром, никель, сера и т. д. [3]. Известно, что их попадание в организм может вызывать окислительный стресс и, как следствие, возникновение различных заболеваний [2][4]. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) тесно связаны с окислительным стрессом, который играет важную роль в патофизиологии. Почти каждый третий работающий во вредных условиях труда в Свердловской области имеет заболевания сердечно-сосудистой системы, которые являются ведущими среди причин смертности населения трудоспособного возраста, в том числе случаев смерти на производстве [1].

Глутатион-S-трансферазы (GST) потенциально играют важную роль в снижении окислительного стресса, а генетические полиморфизмы генов GST могут объяснить вариабельные реакции человека на воздействие ксенобиотиков [5][6]. Генетические вариации генов GSTM1, GSTT1 и GSTP1 вносят вклад в индивидуальные различия в реакции на химические и канцерогенные соединения. Нулевой генотип GSTM1 или GSTT1 приводит к полному отсутствию активности фермента, а GSTP1 Ile105Val – к снижению активности этого фермента [7–9]. Комбинированные мутации в этих генах могут изменять потенциальные риски, вызванные токсичными веществами или продуктами стадий окислительного стресса и воспаления [4]. Накопленные к настоящему времени сведения не создают ясной картины о связи нулевых генотипов GST с риском развития ССЗ.

Цель исследования – изучить особенности генетического полиморфизма генов GSTM1, GSTT1 и GSTP1 у работающих на предприятии нижнетагильского металлургического комбината с заболеваниями сердечно-сосудистой системы.

Материалы и методы. В группе наблюдения было обследовано 61 человек, мужчины, работающие в конвертерном цехе, возраст от 33 до 61 года (средний возраст 48,15 ± 7,50 года), с патологией сердечно-сосудистой системы, относящейся по МКБ-10 к классу болезней I00-I99, занятые на рабочих местах огнеупорщика, разливщика стали, оператора загрузки конвертера, слесаря-ремонтника, электрогазосварщика, сталевара конвертера, машиниста крана металлургического производства, электромонтера по ремонту и обслуживанию электрооборудования, машиниста дистрибутора, шлаковщика, миксерового, ковшевого, оператора машины непрерывного литья заготовок, машиниста транспортировщика горячего металла, сталевара установки внепечной обработки стали, шихтовщика. Группу сравнения составили 29 человек, мужчины, условно здоровые работники предприятия без проявления признаков сердечно-сосудистой патологии, возраст от 23 до 56 лет (средний возраст 44,03 ± 7,63 года). ДНК выделяли из периферической крови по стандартной методике с использованием набора diaGene для выделения ДНК из цельной крови на спин-колонках. Для определения делеционного полиморфизма генов GSTM1, GSTT1 были использованы последовательности праймеров, которые перечислены в табл. 1.

Состав ПЦР-смеси: БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue, прямой и обратный праймеры – по 0,2 мкм каждый, вода и образец ДНК. Амплификация проводилась с помощью амплификатора Quant Studio 3 (Thermo Scientific, США) со следующими условиями: начальная денатурация 5 мин при 95 °С; далее 40 циклов по три шага: денатурация – 15 сек. при 95 °С, отжиг праймеров – 15 сек. при 60 °С, элонгация – 30 сек. при 72 °С. Начальная температура кривых плавления – 59 °С, регистрация флуоресцентного сигнала производилась непрерывно, скорость повышения температуры составляла 0,15 °С/сек. Полученные результаты интерпретировали исходя из анализа графиков накопления флюоресценции, специфичность оценивалась с помощью кривой плавления.

Наличие гомозиготной делеции в генах GSTT1 и GSTM1 регистрировалось только при условии амплификации гена ALB как позитивного контроля. Определение полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 методом qPCR производилось с помощью готового коммерческого набора «SNP-Скрин» (Синтол, Россия). Популяционные частоты аллельных вариантов вычисляли на основе наблюдаемых частот генотипов.

Для сравнения частот генотипов в группах больных и контроля применяли критерии χ² и χ² с поправкой Йейтса для таблиц сопряженности 2 × 2. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ Statistica 12 (StatSoft Inc., USA).

Результаты и обсуждение. В настоящем исследовании мы оценили частоты полиморфизмов GSTT1, GSTM1 и GSTP1, которые могут влиять на индивидуальную восприимчивость к CСЗ, и проверили SNP, которые, как считается, влияют на ферментативную активность.

Не было обнаружено статистически значимой разницы между группами ни по одному из исследуемых генов. Распределение частот генотипов, достоверность различий и значение критерия χ2 представлены в табл. 2.

Также были посчитаны сочетания нулевых генотипов GSTM1 и GSTT1. Так, частота встречаемости сочетания GSTM1 (0/0) и GSTT1 (0/0) у группы наблюдения составила 14 %, а у группы сравнения – 11 %. Однако статистически достоверной разницы между группами обнаружено не было.

Для полиморфизмов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 распределение частот генотипов в изученных выборках соответствовало ожидаемому при равновесии Харди – Вайнберга. Известно, что
частота полиморфных делеционных вариантов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 различается в разных популяциях [11–13]. Нулевой вариант аллеля GSTM1 чрезвычайно широко распространен в человеческой популяции – так, частота делеционного генотипа в Европе составляет 42–58 % [13], что согласуется с полученными нами данными. Частота гомозиготного по «нулевому» аллелю GSTT1 генотипа в популяциях европеоидов составляет 15–30 % [11], а гомозиготного мутантного генотипа (Val/Val) GSTP1 – 10–20 % [12], что также согласуется с полученными нами данными.

В ходе аэробного метаболизма в клетках постоянно происходят реакции с образованием активных форм кислорода, которые представлены в виде гидроксильных радикалов, пероксида водорода, окиси азота и т. д. В связи с их высокой реакционной способностью, данные соединения приводят к окислительному стрессу.

Система обезвреживания с участием GSTs и глутатиона играет важную роль в формировании резистентности организма к самым различным воздействиям и является надежным защитным механизмом клетки. Помимо участия цитозольных GSTs в реакциях конъюгации и изомеризации, они могут ковалентно и нековалентно связывать гидрофобные несубстратные лиганды, что необходимо для внутриклеточного транспорта, изоляции и ликвидации ксенобиотиков [14]. Таким образом, во второй фазе детоксикации ферменты семейства GSTs играют ключевую роль в процессах обезвреживания чужеродных веществ в клетках [15].

Полиморфизм, выявленный в генах данного генного суперсемейства, может оказывать свое непосредственное влияние на активность кодируемых ферментов, что в конечном счете способно приводить к изменениям в клеточном метаболизме.

В исследовании Sobha S.P. et al. было показано, что обнаружение нулевых мутаций GSTM1 и GSTT1 и полиморфизма GSTP1 имеет клиническое значение и может использоваться как биомаркер для ранней диагностики развития ССЗ и ССЗ при сахарном диабете (СД) [6]. В исследовании, проведенном в Малайзии, также были получены достоверные данные о связи делеционного полиморфизма GSTT1 с развитием ССЗ при СД [16]. Другое исследование обнаружило связь риска сердечной недостаточности с аллелем GSTP1 Val [17]. В работе не было выявлено никаких значимых ассоциаций между генотипом GSTT1 и сердечно-сосудистыми заболеваниями, но было продемонстрировано, что нулевой генотип GSTM1 защищает как от ишемической болезни сердца, так и от острого инфаркта миокарда [18], однако исследование Phulukdaree A. et al. показало, что нулевой генотип GSTM1 связан с повышенным в 2,6 раза риском развития ишемической болезни сердца [19]. Исследование, проведенное в Северной Индии, подтвердило связь нулевого генотипа GSTT1 и ишемической болезни сердца [20]. В то же время в ряде исследовании не было показано значительной разницы в частотах нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1 между пациентами и контрольной группой [21–23].

Однако данных о связи развития ССЗ в условиях неблагоприятного воздействия факторов окружающей среды и полиморфизма генов GST, которые опровергали или подтверждали полученные нами результаты, обнаружено не было.

Заключение. В результате проведенного нами исследования было установлено, что присутствие нулевых генотипов GSTM1, GSTT1, а также мутантного аллеля GSTP1 и сопряженная с этим потеря функциональной активности фермента не вносят весомый вклад в развитие ССЗ в условиях влияния производственной среды. Возможно, это связано с тем, что в биотрансформации ксенобиотиков участвуют более 200 ферментных систем, которые частично взаимозаменяют друг друга [24].