Геномный мониторинг вируса SARS-CоV-2, циркулировавшего на территории Кыргызской Республики в 2020–2021 гг.

Введение. В марте 2020 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила COVID-19 глобальной пандемией. В декабре 2019 года в г. Ухани (провинция Хубэй, КНР) был зарегистрирован первый случай заражения вирусом острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2, COVID-19) [1–5]. SARS-CoV-2 является оболочечным одноцепочечным РНК-вирусом, относящимся к семейству Coronaviridae, роду Betacoronavirus [2][6]. 30 января 2020 года ВОЗ объявила SARS-CoV-2 вспышкой и чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение, а 11 марта 2020 года COVID-19 был объявлен пандемией [6].

Предполагается, что SARS-CoV-2 имеет зоонозное происхождение, хотя точный зоонозный источник исходного вируса и обстоятельства его появления у людей остаются неизвестными [7][8]. Известно, что SARS-CoV-2 примерно на 96 % гомологичен с сарбековирусом летучих мышей RaTG13, а специфические гены высококонсервативны у COVID-19 и других коронавирусов летучих мышей [3][9][10]. Филогенетический анализ показывает регулярность случаев рекомбинации между SARS-CoV и коронавирусами летучих мышей [10][11]. Исходя из этих данных возможно предположить, что вирус SARS-CoV-2 произошел от коронавирусов летучих мышей.

Рекомбинация РНК COVID-19 происходит с высокой скоростью [10][12–15] и играет важную роль в их эволюции. Известно, что коронавирусы имеют самые большие известные геномы среди РНК-вирусов, что обеспечивает вирусу дополнительную пластичность для мутаций и рекомбинаций по сравнению с вирусами, содержащими меньший геном [10][14]. Варианты SARS-CoV-2 обычно характеризуются совокупностью специфических мутаций, которые могут повысить их трансмиссивность, контагиозность, иммунологический уклон и фенотипические характеристики [16][17]. Эти свойства позволили COVID-19 быстро распространиться по всему миру с резким увеличением числа случаев [18][19].

По мере того как SARS-CoV-2 распространялся, вирусный геном продолжал приобретать новые мутации, некоторые из которых получили широкое распространение. До конца 2020 года наиболее заметной была мутация S-белка D614G. Вариант G614 стал доминирующим к июню 2020 года [20][21]. Такое быстрое распространение, по-видимому, произошло из-за повышенной контагиозности, стабильности и трансмиссивности по сравнению с уханьской формой D614, что является результатом перехода к открытой конфигурации тримера S-белка, который необходим для связывания с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2) [20] и входа в клетку-хозяина [3][10][20][22].

Повышенная контагиозность вызывает особую озабоченность, поскольку она может потребовать введения более строгих мер общественного здравоохранения. Вариант уклонения от нейтрализации антител может снизить эффективность вакцин, что потребует разработку новых или модификации существующих вакцин. Данные факторы оказывают существенное влияние на борьбу с пандемией [10].

Цель исследования – выявление доминирующих геновариантов вируса SARS-CoV-2, циркулирующих в Кыргызской Республике в 2020–2021 гг.

Материалы и методы. Биологическим материалом для исследования являлись мазки из носоглотки, мокрота и аутопсийный материал в вирусологической транспортной среде от лиц с подозрением на COVID-19, контактные лица и от лиц, выезжающих за пределы республики и сдающих биоматериал с профилактической целью согласно рекомендациям ВОЗ. Всего за период 2020–2021 гг. методом ОТ-ПЦР было исследовано 2 361 654 образца биоматериала. Из них вирус SARS-CoV-2 выявили только в мазках из носоглотки – 109 874 (5,9 %).

Диагностику COVID-19 проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) на следующих зарегистрированных коммерческих тест-системах: ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией «Вектор-ПЦРрв-2019-nCoV-RG» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Российская Федерация), ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией «Вектор-OneStepПЦР-CoVRG» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Российская Федерация), «ОТ-ПЦР в режиме реального времени РеалБест РНК SARS-CoV-2» (АО «Вектор-Бест», Российская Федерация), «ОТ-ПЦР в режиме реального времени SARS-CoV-2/SARSCoV» (ООО «ДНК-Технология-ТС», Российская Федерация), ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией «АмплиСенс® Cov-Bat-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Российская Федерация), SunsureBiotech (Китайская Народная Республика, КНР), BioSpeedy (Турция), WHO (Германия), «Алсенс» (Республика Беларусь). Амплификацию и учет реакции проводили на приборах планшетного и роторного типа: RotorGene (Qiagen, Нидерланды), Biorad (Bio-Rad Laboratories,

Соединенные Штаты Америки, США), DT-96 (ДНКТехнология, Российская Федерация) и GeneXpert (Cepheid GeneXpert, США) при экстренных ситуациях.

Определение геновариантов проводилось методом высокопроизводительного секвенирования на приборе MiSeq (Illumina, США) по протоколу ARTIC v3 с последующим биоинформационным анализом в соответствующих аккредитованных лабораториях ведущих референс лабораториях ВОЗ.

Для исследования были отобраны 33 образца, в том числе 10 образцов, имеющих пороговый цикл ct ниже 27, и 4 образца, имеющих цикл до 31. Нуклеотидные последовательности 33 образцов, выделенных на территории Кыргызской Республики, и 20 образцов из GISAID¹ выравнивали с помощью MAFFT². 19 образцов были удалены в силу низкого качества сиквенса. Кластерный анализ был проведен с применением восходящего агломеративного подхода по методу Уорда³, который предполагает объединение ближайших кластеров, расчет их суммы квадратов отклонений и объединение в кластеры объектов с наименьшим приращением величины суммы квадратов отклонений. Исходное предковое дерево было создано с помощью филогенетического анализа с использованием метода максимального правдоподобия (ML) в IQ-TREE v1.6.12 [23] по модели нуклеотидных замен GTR, которая была выбрана как наиболее подходящая в jModelTest 2.1.7 [24]. Для проверки геноварианта методом ML к выравненным последовательностям из Кыргызской Республики были добавлены эталонные последовательности геновариантов и их сублиний, которые были взяты из базы данных последовательностей SARS-CoV-2 GISAID. Изменения аминокислотных замен S-белков изолятов COVID-19, выделенных на территории Кыргызской Республики, позволил определить 2 клада образцов SARSCoV-2 с высокой статистической поддержкой (PP ≈ 1,0 во всех случаях). В результате субтипирования кыргызских образцов удалось выявить наиболее часто циркулирующие варианты VOC в Кыргызской Республике и в мире – Альфа (B.1.1.7) и Бета (B.1.351). При исследовании мутаций в структурных белках SARS-CoV-2 разных генетических вариантов зафиксировано наибольшее разнообразие замен в S-белке: D138H, A262T, N501Y, D614G и A892V, являющихся примерами общих мутаций между вариантами B.1.1.7 Alpha и B.1.351 Beta. Полученное филогенетическое дерево было подтверждено с использованием локального экземпляра рабочего процесса Nextstrain⁴, который использует анализ ML, реализованный в Tree-Time [25]. Общий набор данных для анализа Nextstrain

ML содержал 35 последовательностей SARSCoV-2: 15 последовательностей S-белков вируса из Кыргызской Республики и 20 полных геномов глобальных последовательностей SARS-CoV-2 в качестве внешней группы, взятых в открытой базе данных. Визуализация дерева была проведена онлайн с помощью Auspice версии 2.24.0⁵. Корнем дерева считались образцы SARS-CoV-2 Wuhan/Hu-1/2019 и Wuhan/WH01/2019, загруженные из базы данных GenBank®. Репрезентативность отбора образцов для секвенирования была обеспечена согласно критериям, рекомендованным ВОЗ⁶.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием стандартных методов описательной статистики с помощью программы Microsoft Office Excel 2010.

Результаты. С целью определения геновариантов SARS-CoV-2, вызывающих озабоченность (variant of concern, VOC) и представляющих интерес (variants of interest, VOI), было исследовано 53 клинических образца с положительным результатом РНК COVID-19. В результате проведения секвенирования было получено 33 нуклеотидные последовательности генома коронавируса SARS-CoV-2 с покрытием от 91 до 99 % bp.

Анализ данных проведенных исследований показал, что доминирующим являлся геновариант B.1.1.7 (Alpha) – 36,4 % (12/33), В 1.1.141 – 12,1 % (4/33), В1.1.29, В 1.1.289 и В 1.1. 294 – по 9,1 % (3/33), B.1.351 (Веtа) и В1.1.84 – по 6,1 % (2/33) (рис. 1). Согласно классификации Центра по контролю и профилактике заболеваний США⁷ (ВОЗ⁸) было обнаружено 14 изолятов VOC вариантов COVID-19. Данные изоляты относились к геновариантам Alpha (B.1.1.7) «Британский» и Веtа (B.1.351) «ЮАР». Остальные геноварианты относились к вариантам VOI.

На рис. 2 представлено филогенетическое дерево, построенное на основе полногеномных нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2, циркулирующих на территории Кыргызской Республики.

Всего для построения филогенетического дерева геновариантов VOC было использовано 35 полногеномных последовательностей SARS-CoV-2, из которых 15 были последовательностями изолятов COVID-19, выделенных на территории Республики Кыргызстан в рамках данного исследования. Были добавлены нуклеотидные последовательности исследованных ранее изолятов COVID-19, выделенных на территории Российской Федерации – 16, на территории Индии – 2 и города Ухани (КНР) – 2.

Филогенетический анализ изученных геномов вируса SARS-CoV-2 показал, что 35 полных последовательностей генома сгруппированы в пять отдельных генетических кластеров – 20B, 20I/501Y. V1, 20A, 19A и 20A/N.194L.

С целью детального изучения эволюции, геномного разнообразия и динамики мутационной изменчивости вируса SARS-CoV-2, циркулирующего на территории Кыргызской Республики, нами был проведен кластерный анализ аминокислотных замен в S-белке. Результаты проведенного анализа представлены в табл. 1 и 2.

Основное число аминокислотных замен в S-белке обнаружено у изолятов, принадлежащих к Британскому варианту В. 1.1.7 Alpha. Обнаружено, что изоляты B.1.1.7 Alpha (Британский) кластеризуются на две отдельные ветви. У изолятов, принадлежащих к южно-африканскому варианту В.1.351 Beta, аминокислотных замен в S-белке не обнаружено.

Обсуждение. В данном исследовании описаны геноварианты коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), циркулирующие на территории Кыргызской Республики в 2021 г. Положительные изоляты COVID-19 были получены от пациентов с симптомами коронавирусной инфекции.

Вирусам SARS-CoV-2 свойственны часто возникающие мутации, которые связаны с чрезвычайно высокой скоростью роста и являются механизмом адаптации к одной и той же клетке-хозяину [10][26][27]. Геновариант Alpha (B.1.1.7) отличается от последовательности SARS-CoV-2 исходного дикого штамма примерно на 30 мутаций и включает сотни тысяч доступных в настоящее время последовательностей [27][28]. Вариант Alpha был впервые обнаружен в городе Кенте (Великобритания) в конце лета 2020 года, а к середине декабря 2020 года составил более трети инфицированного населения страны [27]. К 2021 г. штамм SARS-CoV-2 Alpha (B.1.1.7/GR/501Y.V1/20I) из Великобритании быстро распространился по континентальной Европе, США, Латинской Америке и Российской Федерации [16][17][27][29–32]. Полученные в нашем исследовании данные согласуются с данными из источников литературы, согласно которым на территории Кыргызской Республики в начале 2021 г. также доминировал геновариант Alpha (B.1.1.7) «Британский». Широкое распространение геноварианта – результат повышенной на 90 % по сравнению с предшественниками трансмиссивности Alpha [17][33]. Исследование, проведенное Вассалло и соавт. (2021), показало, что пациенты, инфицированные вариантом Alpha, имели в 3,8 раза более высокий риск смерти или перевода в отделение интенсивной терапии (ОИТ) по сравнению с теми, кто заразился исходным диким штаммом [6][18].

Анализ аминокислотных замен в исследованных нами образцах выявил 9 мутаций – 69-70del, Y145del, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H. Наши данные согласуются с данными источников литературы о том, что геноварианту Alpha свойственно большое количество мутаций (всего 27, исключая мутацию D614G), из которых 20 (17 аминокислотных замен и 3 делеции) являются изменяющими аминокислоты. Восемь из этих мутаций находятся в гене S [10]. Делеция в положении 69/70 (69/70Δ) произошла в нескольких других линиях SARS-CoV-2 в связи с изменениями RBD и может быть связана с уклонением от иммунитета или с инфекционностью [10]. Мутация N501Y находится внутри RBD и влияет на аффинность связывания с рецептором ACE2 [10][34]. Мутация P681H прилегает к участку расщепления фурином на стыке доменов S1 и S2 белка-шипа, что улучшает трансмиссивность вируса и проникновение в клетки легких [10][35][36]. Недавние данные свидетельствуют о том, что частота мутаций в положении 681 растет экспоненциально во всем мире [10][37]. Эти данные могут свидетельствовать о процессе эволюции данного геноварианта коронавируса в локальных популяциях на территории Кыргызской Республики.

Еще одним геновариантом вируса SARS-CoV-2, выявленным на территории Кыргызской Республики в нашем исследовании, был геновариант Beta (B.1.351). Первый случай геноварианта Beta-варианта был выявлен в заливе Нельсона Манделы (Южно-Африканская Республика, ЮАР) в октябре 2020 года. К концу ноября 2020 года эта линия преобладала в Восточно-Капской и Западно-Капской провинциях ЮАР. К январю 2021 года было известно о 415 случаях заражения этим вариантом, обнаруженных в 13 разных странах [27]. Анализ аминокислотных замен в исследованных нами образцах выявил 9 мутаций – L18P, D80A, D215G, 242-244del, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V. Согласно данным литературы этот геновариант имеет 19 мутаций (исключая D614G), включая 8 мутаций в области гена S, в дополнение к вариабельным изменениям в положении L242 (делеция или другая несинонимичная замена) [27][38]. Три из этих мутаций находятся в ключевых сайтах RBD, связанных с уклонением от иммунного ответа: N501Y (общий с Alpha), E484K и K417N [10][35]. Эти мутации могут привести к изменениям конформации, ставящие под угрозу эффективность вакцин [27][39–41].

Выявленные на территории Кыргызской Республики геноварианты являются широко распространенными, которые стали доминирующими вариантами не только в тех географических регионах, где они были впервые идентифицированы. По состоянию на 14 января 2024 года⁹ геноварианты Alpha «Британский» и Beta «ЮАР» являются широко распространенными и были зарегистрированы в 190 странах и 131 стране соответственно. Быстрое распространение различных геновариантов SARSCoV-2 убедительно свидетельствует о том, что эти варианты имеют преимущества в передаче перед предковыми вирусами [10].

Заключение. Эпидемические волны COVID-19 часто ассоциируются с появлением новых геновариантов вируса SARS-CoV-2. Появление геновариантов, несущих мутации, повышающих контагиозность и трансмиссивность, а также способствующих уклонению от антител, могут потенциально негативно влиять на эффективность программ борьбы с заболеванием, снизить эффективность вакцинации и привести к новым пандемиям. Проведение геномного мониторинга за циркулирующими на территории Кыргызской Республики геновариантами вируса SARS-CoV-2 может служить предиктором развития коронавирусной инфекции в стране, что и позволит своевременно принимать меры по противодействию распространению вируса SARS-CoV-2.