Оценка генетического разнообразия возбудителя норовирусной инфекции в пунктах временного размещения беженцев в Ростовской области в 2022 году с помощью онлайн-программы NoroNetRus

Введение. Норовирус является одной из ведущих причин острого небактериального эпидемического гастроэнтерита во всем мире, поскольку имеет несколько путей передачи и высокую устойчивость к дезинфицирующим средствам [1][2]. Ежегодно в мире фиксируется миллиард случаев этой инфекции, среди которых 200 000 со смертельным исходом¹ . В 2020 г. в Российской Федерации зарегистрировано 103 очага групповой заболеваемости НВИ с общим числом пострадавших 1480 человек (в 2019 г. – 215 и 2705 соответственно)² .

Немаловажно, что смена или появление нового генотипа норовируса приводит к росту как спорадической, так и групповой заболеваемости вплоть до возникновения новых эпидемических вариантов вируса, склонных к быстрому распространению [3–5]. Норовирусы представляют собой группу генетически разнообразных, одноцепочечных РНК-вирусов. Род Norovirus относится к семейству Caliciviridae и содержит только один вид: вирус Norwalk.

В 2013 г. международная рабочая группа по классификации норовирусов предложила универсальную номенклатуру обозначения генотипа, включающую определение типа капсида (G-тип) и полимеразы (P-тип) [6]. Согласно современной классификации норовирусы подразделяются на десять геногрупп (GI-GVI) и 48 генотипов. Из этих семи геногрупп только GI, GII и GIV содержат человеческие норовирусы, причем вторая геногруппа (GII) встречается в 10 раз чаще [7]. Существует восемь генотипов капсида, принадлежащих GI, и 21, принадлежащий GII. С 2001 г. большинство вспышек во всем мире вызвано вирусами GII.4, хотя периодически появляются другие генотипы, такие как GII.17 и GII.2 [1].

Очевидно, что эффективное расследование вспышек норовирусной инфекции невозможно без методов, способных дифференцировать генотипы возбудителя, что может быть полезным при выявлении связей между отдельными очагами инфекции и путей передачи возбудителя.

Одним из наиболее широко распространенных подходов для оценки получаемых данных является использование онлайн программы Norovirus Genotyping tool, позволяющей быстро определять G и P тип вируса, исходя из данных секвенирования. Программа рассчитана на работу в режиме онлайн и расположена на сервере Национального института общественного здравоохранения и окружающей среды (Нидерланды) (http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool). Аналогичный сервис представлен на сайте Centers for Disease Control and Prevention (США) (https://norovirus.ng.philab.cdc.gov/bctyping.html). Однако в последнее время наблюдается неустойчивая работа указанных сервисов и их периодическая недоступность с ряда IP-адресов, находящихся в Российской Федерации, что может оказать влияние на оперативность расследования вспышек НВИ в нашей стране. Помимо этого, одной из целей Указа Президента от 7 мая 2018 г. № 2043 «О национальных целях и стратегических задачах…» является использование преимущественно отечественного программного обеспечения государственными органами, органами местного самоуправления и организациями.

В связи с этим цель настоящего исследования состояла в разработке отечественного программного обеспечения для генотипирования норовирусов и оценке с его помощью генетического разнообразия возбудителя норовирусной инфекции, выявленного в 2022 г. в Ростовской области.

Материалы и методы. Контингент обследуемых – пациенты в возрасте от 1 месяца до 74 лет с симптомами острых кишечных инфекций (ОКИ) в 2022 г. Материалом для исследования послужили образцы фекалий от 210 больных с симптомами ОКИ из пунктов временного размещения беженцев и детских организованных коллективов. Все пациенты и их законные представители подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Выявление РНК возбудителя норовирусной инфекции проводили с использованием набора реагентов «АмплиСенс® ОКИ скрин-FL» (Москва, Россия). Фрагментарное секвенирование проводили на геномном анализаторе SeqStudio (Thermo Fisher, США) с использованием праймеров, предложенных Cannon JL (2017).

Геномные последовательности возбудителя норовирусной инфекции для определения генотипов и создания собственного программного обеспечения получали из базы данных NCBI. Для сравнительного анализа геномов норовируса использовали программу Mega [8]. Для построения дендрограммы применяли алгоритм UPGMA. Авторское программное обеспечение разрабатывали на языках программирования Java и Python. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей в рамках создаваемого программного обеспечения использовали модуль Scikit [9].

Результаты. Первый этап работы состоял в составлении локальной базы данных референсных последовательностей. С этой целью былииспользованы обновленные данные по классификации норовирусов, предложенные Chhabra P и соавт. [10]. Для этого из базы данных NCBI были получены геномы норовируса каждого G и P типа, и после их выравнивания получены последовательности генов VP1 и RdPr.

Согласно предлагаемому нами алгоритму, каждая анализируемая последовательность норовируса поочередно выравнивается с помощью локального выравнивания по алгоритму Смитта – Ватермана с аффинными штрафами за вставки и делеции с каждой последовательностью из созданной локальной базы данных. В качестве критерия оценки используется количество совпавших нуклеотидов, что позволяет определить наиболее близкородственную референсную последовательность. Соответственно, поочередное проведение выравнивания с последовательностями генов капсида (VP1) и полимеразы (RdPr) позволяет определить G и P тип анализируемого норовируса.

С этой целью на языке программирования Python нами разработана программа NoroNetRus, предназначенная для работы в онлайн-формате, и расположена на сайте института по адресу: http://antiplague.ru/noronetrus. Внешний вид программы представлен на рис. 1.

Программа имеет интуитивно-понятный интерфейс, предназначена для работы через любой браузер с поддержкой JavaScript. В качестве входных данных используется fasta-файл, содержащий данные фрагментарного секвенирования норовируса. Время на анализ одной последовательности составляет от 0,5 до 3 секунд. Итогом работы программы являются типы генов VP1 и RdPr, например «Vp1: GII.17, RdRp: GII.P3».

Для валидации работы программы из базы данных NCBI нами были скачаны 100 случайных геномов норовируса и проведена виртуальная ПЦР in silico с праймерами, захватывающими фрагмент обоих генов [11]. Полученные ампликоны (фрагменты ДНК, ограниченные праймерами) были поочередно проверены в программах NoroNet (Нидерланды) и разработанной нами NoroNetRus.

По итогам валидации программа NoroNetRus на первом этапе определила G и P тип для всех последовательностей, в то время как алгоритм NoroNet (Нидерланды) не определил тип вируса для 8 последовательностей. В оставшихся 92 последовательностях обнаружено всего одно несоответствие – тип полимеразы в геноме вируса, депонированном в NCBI под номером KY424345, разработанная нами программа определила как GII.P7, в то время как программа NoroNet определила тип как GII.P6. Важным преимуществом является невозможность определения субтипов варианта капсида GII.4 при использовании программы NoroNet, что ограничивает возможности валидации. В то же время разработанная нами программа NoroNetRus успешно решает эту задачу.

При обследовании 210 пациентов с симптомами ОКИ в марте 2022 г. нами было выявлено 110 положительных проб, содержащих РНК норовируса в пяти эпидемических очагах. Два очага сформировались в пунктах временного размещения беженцев (ПВР-1 и ПВР-2), прибывших на территорию Ростовской области из Донецкой и Луганской народных республик. В этот же период было выявлено еще три очага в детских образовательных учреждениях (ДОУ) г. Ростова-на-Дону и г. Батайска. Для оценки генетического разнообразия нами проведено фрагментарное секвенирование участка гена VP1 (основной белок капсида) у 25 изолятов вируса.

Использование разработанной нами программы NoroNetRus позволило установить тип капсида для всех 25 образцов (таблица).

Обращает на себя внимание, что в ряде очагов циркулировали изоляты вируса, принадлежащие к одному генотипу: так, в ДОУ-А и ПВР-1 выявлена циркуляция генотипа GII.4 Sydney, а в ДОУ-Б – генотипа GII.10. В то же время в двух других очагах наблюдалась одновременная циркуляция сразу нескольких генотипов: в ДОУ-В выявлены генотипы GII.4 Sydney и GII.17, а в ПВР-2 – GII.4 Sydney и GII.10.

Для анализа мирового распространения норовируса из базы данных NCBI были получены 5947 последовательностей гена VP1 различных штаммов и с помощью разработанного нами программного обеспечения определен их генотип (рис. 2). Установлено, что наиболее распространенным в мире явился генотип GII.4 Sydney, к которому отнесено 17 % всех последовательностей. В России доминирующим явился генотип GII.3 (22 %), в то время как GII.4 Sydney занимает 4-е место по частоте встречаемости (12 %). За последние 5 лет выделение штаммов данного генотипа в России зарегистрировано в Новосибирске и Нижнем Новгороде.

Частота встречаемости генотипа GII.10 составила 0,02 % для мировой коллекции и 0,04 % – для России. За последние годы выделение штаммов GII.10 зарегистрировано в Испании (2019–2020 гг.) и Эфиопии (2016 г.). В России данный вариант выделялся в Челябинске в 2005 г.

Обсуждение. Норовирусы генотипа GII.17, по данным литературы, явились причиной вспышек в Хабаровском крае в 2015 г. и Амурской области в 2018 г. [12]. Интересно отметить, что норовирус GII.17 стал доминирующим генотипом в Осаке (Япония) [13], Южной Корее [14], Канаде [15], Италии [16], заменив генотип GII.4.

Вместе с тем на ряде территорий регистрируется одновременная циркуляция большого числа генотипов норовируса. Так, в Ботсване в период 2013–2015 гг., несмотря на доминирование генотипа GII.4, наблюдалось выделение минорных генотипов GII.2, GII.12, GI.9, GII.6, GII.10 [17]. Сходная ситуация наблюдалась в Эфиопии [18], Корее [19], ЮАР [20], Канаде [21].

Интересно, что отдельные вспышки, как правило, вызываются одним типом норовируса. Так, например, водная вспышка в г. Хабаровске в 2019 году была вызвана генотипом GII.P7-GII.6 [22]. Вспышка НВИ, ассоциированная с употреблением мороженного, инфекции в Бразилии в 2020 году была вызвана генотипом GII.12 [23]. Это позволяет использовать генотипирование в качестве удобного инструмента для выявления источника заражения, что и было с успехом продемонстрировано в Китае в 2017 году – проведенный анализ показал, что развитие вспышки норовируса GII.P17-GII.17 было связано с системой водоснабжения [24].

Для более точного анализа проведено выравнивание полученных фрагментов гена VP1 и построена дендрограмма, отражающая степень генетической близости между изучаемыми изолятами (рис. 3). К сожалению, в базе данных NCBI отсутствуют последовательности вируса, выделенные в Южном федеральном округе России и на Украине, что ограничивает возможности проведения анализа. При добавлении в перечень последовательностей штаммов из сопредельных государств наиболее генетически близкородственными оказались последовательности вируса, выделенного в Республике Беларусь в 2021 г. (данные не представлены).

Обращает на себя внимание, что по данным дендрограммы штаммы норовируса генотипа GII.10 образуют два разных кластера: в один кластер попали варианты вируса из ДОУ-Б, в другой – из ПВР-2. При проведении выравнивания нуклеотидных последовательностей 4774 (ПВР-2) и Е1604 (ДОУ-Б) выявлено сходство 89,7 %, при этом между собой последовательности 4774 и 4779 совпадали на 100 %. Примечательно, что поиск с использованием алгоритма BLAST не нашел близкородственных штаммов для вирусов из ПВР-2, что может свидетельствовать о новом подтипе GII.10, не включенном в существующую международную классификацию.

Аналогичная гетерогенность внутри одного генотипа была показана ранее на примере норовируса GII.17. Так, было показано, что данный генотип можно разделить на четыре различные клады [25]. В последующем было установлено, что скорость эволюции гена VP1 норовируса генотипа составляет 1,14 × 10–3 нуклеотидных замен/год [26].

Исследованные нами варианты норовируса GII.4 Sydney образовали единую группу, имея не более 0,5 % отличий друг от друга.

Заключение. Таким образом, в ходе проведенной работы был создан набор референсных последовательностей генов VP1 и RdPr норовируса второй геногруппы. Разработан алгоритм анализа данных секвенирования возбудителя норовирусной инфекции и создана отечественная программа NoroNetRus, позволяющая определять тип капсида и полимеразы норовируса, исходя из данных секвенирования. Программа бесплатнаи доступна в онлайн-формате по адресу: http://antiplague.ru/noronetrus.

Проведена валидация работы программы с использованием 100 случайных последовательностей из базы данных NCBI, подтвердившая корректность проводимого анализа.

Было проведено фрагментарное секвенирование последовательностей гена VP1 для 25 образцов норовируса, выделенных в марте 2022 г. из пунктов временного размещения беженцев и детских образовательных учреждений (ДОУ) г. Ростова-на-Дону и г. Батайска. Показано, что они принадлежали к трем разным генотипам (GII.4 Sydney, GII.10 и GII.17), причем генотип GII.10, в свою очередь, распределился между двумя разными кластерами. Полученные данные свидетельствуют о существовании как минимум четырех различных источников инфицирования