Генетическое профилирование штаммов Salmonella enteritidis, выделенных на территории Ставропольского края в 2016–2019 гг.

Введение. Занимающий одно из ведущих мест в структуре острых кишечных бактериальных инфекций сальмонеллез характеризуется сложностью этиологической структуры, полиморфизмом клинических проявлений и формированием бактерионосительства. В России, несмотря на тенденцию к снижению распространения, сальмонеллезы занимают третье место (после ротаи норовирусной инфекции) в структуре заболеваемости с фекально-оральным механизмом передачи возбудителя¹.

Для Ставропольского края сальмонеллез остается значимой инфекционной патологией с высокими эпидемиологическими рисками формирования очагов с множественными случаями заболеваний. В 2019 году произошел двукратный рост заболеваемости по сравнению с 2016–2018 гг.

На территории Ставропольского края находятся Кавказские Минеральные Воды (КМВ) – группа курортов федерального значения, особо охраняемый эколого-курортный регион Российской Федерации. Интенсивное развитие туристической отрасли края существенно увеличивает угрозу возникновения эпидемических ситуаций в регионе, в т. ч. массовых вспышек ОКИ, и обуславливает необходимость совершенствования системы эпидемиологического надзора и внедрения эффективного алгоритма идентификации штаммов для расследования вспышек и отдельных случаев заболевания ОКИ.

В Ставропольском крае наиболее частым этиологическим агентом сальмонеллезов у людей является Salmonella enterica subsp. enterica serovar enteritidis (S. enteritidis), что соответствует общемировой тенденции [1]. Этот серовар выделяется в 84,1 % всех диагностированных случаев сальмонеллеза в крае². В связи с этим определение серовара дает мало информации в ходе эпидемиологического расследования и обуславливает необходимость субвидового типирования изолятов S. enteritidis.

В последние годы широкое практическое применение для субвидовой характеристики микроорганизмов получили методы молекулярно-генетического анализа, обладающие большей дифференцирующей способностью по сравнению с фенотипическими методами исследования.

Молекулярное типирование S. enteritidis наиболее часто проводят с использованием методов гель-электрофореза в пульсирующем поле (PFGE-типирование), мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов (Multi Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis – MLVA) и полногеномного секвенирования (Whole Genome Sequencing – WGS) [2][3]. Применяемый для определения подтипов сальмонелл метод PFGE трудоемок, требует наличия специализированного оборудования и обученного персонала, время выполнения анализа составляет около трех суток [4]. Метод WGS обладает наибольшей дискриминирующей способностью, однако является дорогостоящим, требует проведения сложного биоинформационного анализа и пока не подходит для рутинного субвидового типирования S. enteritidis [5].

MLVA-типирование основано на анализе локусов с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR-variable number tandem repeats). VNTR-локусы являются важным маркером полиморфизма генов, используемых для типирования близкородственных штаммов. Метод MLVA является основным для типирования сальмонелл в странах Европы, что связано с быстротой выполнения анализа и высокой воспроизводимостью результатов [6][7]. Анализ MLVA-профилей штаммов позволяет идентифицировать клоны и дифференцировать штаммы при расследовании вспышек, эффективно устанавливать или исключать связь между отдельными случаями заболеваний [8][9][10]. В странах ЕС разработаны стандартные операционные процедуры по выполнению MLVA-типирования сероваров S. enteritidis и S. typhimurium [11].

Для эффективного применения молекулярно-генетических методов при решении различных эпидемиологических задач необходимо накопление сведений об особенностях генотипов штаммов, циркулирующих в исследуемом регионе, а также информации о генетической гетерогенности возбудителя в мире. Молекулярное типирование штаммов S. enteritidis, выделенных на территории Ставропольского края, позволит получить новую информацию о генетической структуре популяции сальмонелл в регионе, сформировать базу данных для молекулярного анализа при эпидемиологическом расследовании случаев заболевания ОКИ.

Цель исследования: провести MLVA-типирование штаммов S. enteritidis, выделенных на территории Ставропольского края в 2016–2019 гг., проанализировать генетическую структуру популяции сальмонелл в регионе.

Материалы и методы.

В работе использованы 122 штамма S. enteritidis, изолированных в 2016–2019 гг. из проб испражнений больных острыми кишечными инфекциями в Ставропольском крае, в т. ч. в г. Ставрополе (90 штаммов) и регионе КМВ (32 штамма). Случаи ОКИ эпидемиологически не связаны между собой. В этот период отмечалась спорадическая заболеваемость ОКИ, очаги групповой заболеваемости ОКИ не зарегистрированы.

Видовую идентификацию проводили по ферментативной активности в отношении различных субстратов с использованием наборов реагентов для идентификации энтеробактерий ММТЕ1 и ММТЕ2 (НПО «Аллерген», г. Ставрополь). Определение антигенной структуры штаммов выполняли в реакции агглютинации с сыворотками диагностическими сальмонеллезными адсорбированными к О- и Н-антигенам сальмонелл «ПЕТСАЛ» (производства СПбНИИВС Россия).

Выделение бактериальной ДНК производили с помощью набора реагентов «ДНК-Сорб-В» (производства ФБУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г. Москва, Россия). Полученные образцы ДНК использовали для амплификации фрагментов генома изучаемых штаммов S. enteritidis.

MLVA-типирование проводили в соответствии с протоколом, разработанным Hopkins K.L. [12]. Для амплификации VNTR-локусов использовали праймеры, указанные в статье Malorny B. [13] (табл. 1). Размер амплифицированных локусов определяли методом капиллярного электрофореза на секвенаторе Applied Biosystems 3500 (США). Точный размер различающихся по длине аллелей определяли секвенированием по Сэнгеру с использованием Big Dye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Индивидуальный MLVA-генотип штамма был получен на основании числа тандемных повторов в локусах: SENTR7-SENTR5-SENTR6-SENTR4- SE3.

Результаты. Проведено MLVA-типирование 122 штаммов S. enteritidis, выделенных от больных ОКИ в Ставропольском крае с 2016 по 2019 г. Исследованные штаммы отличались высокой генетической гетерогенностью и относились к 25 MLVA-генотипам. Наибольшее количество разных аллельных вариантов (8) выявлено в локусе SENTR5. В локусе SENTR6 выявлено 6 разных аллелей, в SENTR4 – 4, в локусах SENTR7 и SE3 – по 2.

На территории г. Ставрополя выявлены штаммы S. enteritidis, принадлежащие к 24 MLVA-типам, 74,4 % штаммов, выделенных в г. Ставрополе за весь период наблюдений, относились к семи наиболее распространенным MLVA-генотипам (табл. 2). Также выявлены минорные геноварианты, доля которых составляла 1,1–2,2 % от общего количества исследованных изолятов (в совокупности 25,6 %).

Доминирующим геновариантом в г. Ставрополе являлся 3-10-5-4-1, к которому относилось 40 штаммов сальмонелл (44,4 %), выделенных в 2016–2019 гг. В отдельные годы возрастал удельный вес других геновариантов: 2-10-8-3-2, 3-10-5-3-1, 3-11-5-4-1, 3-10-5-3-1, 2-10-14-6-1, 2-12-8-3-2 и 3-18-5-4-1. Ежегодно с 2016 по 2019 г. на территории г. Ставрополя встречались штаммы S. enteritidis, принадлежащие к MLVAгенотипам 3-10-5-4-1 и 3-9-5-4-1. В 2016 г. выявлены 11 геновариантов сальмонелл, преобладали штаммы с MLVA-генотипами 3-10-5-4-1 (36,4 %) и 2-10- 8-3-2 (13,6 %). В 2017 г. исследованные культуры принадлежали к 14 геновариантам, доминирующими являлись MLVA-типы 3-10-5-4-1 (53,5 %) и 3-10-5-3-1 (11,6 %). В 2018 г. выявлено 7 геновариантов S. enteritidis, отмечались изменения в соотношении генетических типов сальмонелл, доминирующим вариантом являлся 2-10-8-3-2 (23,1 %), доля варианта 3-10-5-4-1 снизилась до 15,4 %, выявлены штаммы MLVA-типов 2-12-8- 3-2 и 3-18-5-4-1 (по 2 штамма, 15,4 %). В 2019 г. исследованные штаммы относились к 4 вариантам, преобладал 3-10-5-4-1 (58,3 %), доля варианта 3-11-5-4-1 возросла до 25,0 %.

В регионе КМВ в 2016–2019 гг. выявлены штаммы S. enteritidis, принадлежащие к 7 MLVA-типам, большинство культур относилось к МLVA-генотипу 3-10-5-4-1 (31,3 %). В 2016 г. в городах-курортах КМВ выделены культуры S. enteritidis, относящиеся к трем MLVA-типам, преобладали штаммы геноварианта 3-9-5-4-1 (50,0 %). В 2017 г. доминирующим вариантом являлся 3-10-5-4-1 (75,0 %). В 2019 г. выявлено шесть геновариантов сальмонелл, преобладали штаммы генотипа 3-10-5-3-1 (28,6 %) (табл. 3).

Обсуждение. Метод MLVA-типирования широко применяется для оценки генетической гетерогенности штаммов S. enteritidis в мире, в том числе для выявления эпидемических геновариантов сальмонелл, способных вызывать вспышки сальмонеллеза на территории нескольких государств, и отслеживания возникновения новых генетических вариантов. Для накопления, хранения и обмена результатами MLVA-типирования сальмонелл, выделенных в странах ЕС и других регионах, а также для принятия управленческих решений в области общественного здравоохранения был разработан модуль Enter-net на платформе The European Surveillance System (TESSy) [14].

Ретроспективное генетическое типирование S. enteritidis в Европе позволило выявить эпидемические варианты сальмонелл, преобладающие на территории большинства европейских государств, а также многочисленные минорные варианты, вызывающие спорадические случаи заболевания сальмонеллезами. Так, штаммы S. enteritidis, относящиеся к MLVA-типам 3-10-5-4- 1, 3-11-5-4-1, 2-10-7-3-2, 3-9-5-4-1, доминировали в Португалии в период с 2012 по 2019 г. [15], являлись наиболее часто выявляемыми вариантами в Бельгии в 2007–2012 гг. [16], в Венгрии и Австрии в 2016–2017 гг.

В 2010 г. в ЕС были выявлены штаммы S. enteritidis, относящиеся к новым MLVA-типам: 2-10-6-3-2, 2-10-8-3-2 и 2-11-8-3-2, вызвавшие в 2016–2017 гг. вспышку сальмонеллеза, охватившую территорию большинства европейских стран [17].

Отмечена корреляция между увеличением доли эпидемических MLVA-типов S. enteritidis в регионе и ростом числа случаев сальмонеллезов [10].

Встречающиеся на территории края MLVAтипы (3-10-5-4-1, 3-9-5-4-1, 3-11-5-4-1 и 2-10-8- 3-2) широко распространены в мире, обладают значительным эпидемическим потенциалом. Менее распространенный геновариант 2-11-8-3-2, доля которого увеличилась в г. Ставрополе в 2018 г., вызвал рост заболеваемости S. enteritidis PT-8 в странах ЕС в 2017 г. [18].

В Российской Федерации для проведения молекулярно-генетического мониторинга за циркуляцией штаммов S. enteritidis используются методы PFGE и MLVA [19][20]. В 2011–2019 гг. при поведении субтипирования штаммов методом PFGE c помощью эндонуклеаз рестрикции XbaI BlnI в РФ выделены S. enteritidis, относящиеся к 102 PFGE-типам. Наиболее распространенным у человека являлся субтип JEG01/001/JECA26/001, доля которого составляла 44 % от всех клинических изолятов S. enteritidis в РФ. Отмечались существенные различия в разнообразии выделяемых PFGE-типов в отдельных регионах страны [21].

В результате работы получены новые данные о MLVA-генотипах S. enteritidis, встречающихся на территории Ставропольского края (г. Ставрополь и регион КМВ). Большинство клинических изолятов S. enteritidis, выделенных в 2016–2019 гг. на территории г. Ставрополя и региона КМВ, принадлежали к MLVA-генотипу 3-10-5-4-1, их доля в г. Ставрополе составила 44,4 %, в регионе КМВ – 31,3 %. На территории г. Ставрополя отмечено доминирование данного варианта в 2016, 2017, 2019 гг., и только в 2018 г. превалирующим вариантом стал 2-10-8-3-2. В регионе КМВ ежегодно отмечалась смена доминирующего варианта, что может быть связано с высокой миграционной активностью населения и относительно небольшим количеством исследованных штаммов.

Ретроспективное исследованиe штаммов S. enteritidis, выделенных на территории Ставропольского края в 2016–2019 гг., показало, что большинство изученных штаммов сальмонелл (100 штаммов, 81,96 %) относятся к восьми наиболее распространенным генотипам. Количественное соотношение MLVA-типов S. enteritidis, изолированных на территории Ставропольского края, в целом схоже с соотношением PFGE-генотипов S. enteritidis, выявленных в РФ: к одному преобладающему MLVA-типу относятся 41 % штаммов, изолированных в Ставропольском крае. В России в последние годы также установлено превалирование одного PFGE-субтипа S. enteritidis [21].

Регулярный мониторинг за возникновением новых геновариантов сальмонелл, способных обладать повышенной вирулентностью и быть причиной изменений в патогенезе заболевания, является неотъемлемой частью современного эпиднадзора за ОКИ. Он имеет большое значение для здравоохранения в плане прогнозирования возможных сценариев развития эпидситуации с целью профилактики заболеваемости ОКИ бактериальной этиологии.

Метод MLVA показал высокую разрешающую способность при субтипировании штаммов S. enteritidis [19][20]. В то же время наличие космополитных штаммов может затруднять расследование вспышек, и в некоторых случаях необходимо выполнение WGS (whole genome sequencing).

Заключение. Таким образом, в результате проведенных исследований получены новые данные о MLVA-генотипах S. enteritidis, встречающихся на территории Ставропольского края (г. Ставрополь и регион КМВ). Определены доминирующие в регионе геноварианты, отмечены различия в соотношении циркулирующих MLVA-генотипов S. enteritidis в 2016–2019 гг. Это диктует необходимость постоянного молекулярно-генетического мониторинга для оценки динамических изменений генетической структуры популяции сальмонелл в режиме реального времени.

Применение метода MLVA-типирования штаммов позволит не только проводить анализ генетической структуры популяции сальмонелл, но и эффективно устанавливать или исключать связь между отдельными случаями заболеваний, прогнозировать развитие эпидемиологической ситуации на основании данных о соотношении геновариантов сальмонелл в регионе. Полученные в результате работы данные могут быть использованы при эпидемиологическом анализе возможных случаев (вспышек) сальмонеллеза для определения источника и путей распространения инфекции.