Вопросы безопасного использования БАД к пище на растительной основе (обзор)

Введение. Широкое применение специализированных пищевых продуктов, в том числе БАД к пище на растительной основе, обусловлено наличием в их составе самых разнообразных биологически активных веществ (БАВ) – пищевых волокон и их составляющих, витаминов и их активных метаболитов, макро- и микроэлементов, фитонутриентов и других минорных биологически активных веществ.

В настоящее время в составе пищевой продукции, в том числе БАД к пище, могут использоваться только растения, имеющие традиции пищевого применения¹ – утвержден перечень, включающий около 400 запрещенных при производстве БАД к пище растений и продуктов их переработки² . В этот перечень вошли компоненты растительного происхождения, содержащие вещества канцерогенного, гепатотоксического и курареподобного действия, а также оказывающие наркотическое, психотропное и галлюциногенное действие. Определены адекватный и верхний допустимый уровень суточного потребления биологически активных веществ – фитонутриентов в составе БАД к пище³ . Данные вещества оказывают выраженное влияние на метаболизм и иммунный статус организма [1–3]. Однако некоторые растения, содержащие в своем составе определенные БАВ, могут оказывать негативное влияние на состояние здоровья. Так, например, растения семейства Lamiaceae могут оказывать гепатотоксичное действие на организм [4]. К БАВ, содержащимся в травах и растениях данного семейства и других, относятся пулегон, ментофуран, эстрагол, метилэвгенол, сафрол, туйон и их метаболиты.

Максимально допустимые уровни (МДУ) этих БАВ регламентируется в составе ароматизаторов, изготавливаемых на основе трав и пряностей, а также в пищевой продукции, полученной с использованием ароматизаторов из растительного сырья⁴. Несмотря на большие объемы потребления (по сравнению с ароматизаторами), содержание данных БАВ не регламентируется в составе БАД к пище на основе растительного сырья, также не разработаны методы их анализа в данном виде пищевой продукции.

Цель исследования: анализ и обоснование необходимости регламентации максимально допустимых уровней содержания монотерпенкетонов (пулегона, ментофурана, туйона) и алкенилбензолов (эстрагола, метилэвгенола, сафрола) в растительном сырье и БАД к пище на его основе в соответствии с данными, представленными в настоящее время в отечественных и международных научных публикациях.

Материалы и методы. Использованы информационно-аналитические методы, методы экспертной оценки на основе обобщения и анализа современных научных исследований, опубликованных на русском и английском языках в реферативных базах данных Scopus, Web of Science, PubMed и РИНЦ за период 2001–2021 гг. Ключевые слова для поиска: пулегон, ментофуран, метилэвгенол, эстрагол, сафрол, туйон. В первоначальную выборку попало 43 статьи, из них 13 статей были исключены из выборки после первичного анализа. Отбор статей осуществлялся по принципу наличия в них сведений о метаболизме, уровнях содержания в травах, пищевых продуктах, токсическом действии на организм экспериментальных животных, возможном влиянии на здоровье человека вышеуказанных биологически активных веществ. Авторы отобрали 30 полнотекстовых материалов, удовлетворяющих вышеуказанным критериям. Результаты исследований систематизированы по типу интервенций.

Результаты исследования. Токсиколого-гигиеническая характеристика монотерпенкетонов, при определенных условиях оказывающих негативное влияние на здоровье человека.

Пулегон – оксигенированный монотерпенкетон, в больших количествах присутствующий в растениях семейства Lamiaceae. Пулегон является основным составляющим нескольких видов мяты (Mentha) и получаемых из них эфирных масел, в том числе мяты яблочной (M. rotundifolia), имбирной (M. gentilis), полевой (M. arvensis), корсиканской (М. requienii Benth), длиннолистной (М. longifolia), перечной (M. piperita), колосовой (M. spicata), европейского (M. pulegium) и американского пеннирояля (H. pulegioides). Также пулегон был обнаружен в различных концентрациях в растениях семейства Rutaceae, Asteraceae (табл. 1) [5–8].

Пулегон легко всасывается в организме человека. Он метаболизируется до изомеров гидроксипулегона, преимущественно путем окисления в печени в 5-м, 9-м и 10-м положениях. Дополнительно 9-гидроксипулегон окисляется до ментофурана, который превращается в реакционноспособные эпоксид и альдегид (γ-кетоеналь) ментофурана. 5-гидроксипулегон превращается в пиперитенон, который затем гидроксилируется в положении 9 и далее превращается в аналогичный метаболит фурана и γ-кетоеналь. Дальнейший метаболизм γ-кетоеналя происходит с образованием 4-метил-2-циклогексенона и п-крезола [5].

По результатам проведенных исследований были получены данные о гепатотоксичности пулегона.

При внутрибрюшинном введении крысам разовой дозы пулегона в количестве 250 мг/кг происходило заметное снижение микросомального цитохрома P-450, амидопирин-N-деметилазы и активности глюкозо-6-фосфатазы, а также значительное увеличение уровня трансаминаз и сывороточного глутамат пирувата [9].

Согласно другим проведенным исследованиям трем экспериментальным группам животных (мыши) внутрижелудочно вводился пулегон в количестве 25, 50 и 100 мг/кг соответственно.

Во всех трех группах наблюдалось угнетение активности гена CYP19A1, отвечающего за кодирование белков, а также транскрипционного фактора, регулирующего клеточный цикл, – белка p53, выполняющего функцию супрессора образования злокачественных опухолей. Вместе с тем пулегон снижал экспрессию регулятора апоптоза Bcl-2 – внутриклеточного белкового фактора, подавляющего апоптоз во многих клеточных системах, включая лимфогематопоэтические и нейрональные клетки, а также регулирующего клеточную смерть, контролируя проницаемость митохондриальной мембраны. Негативно влияя на альфа-, бета-рецепторы эстрогена, пулегон нарушал ангиогенез в яичниках, повышая атрезию фолликулов и снижая уровень эстрогена и прогестерона в сыворотке крови. При этом наблюдался дозозависимый эффект – более высокие концентрации пулегона приводили к наиболее тяжелому токсическому действию на организм экспериментальных животных [10].

В исследованиях токсичности пулегона и ментофурана (при введении по отдельности или одновременно), проводимых на крысах в течение 28 дней, для них была установлена NOEL (доза, не вызывающая заметных изменений в организме животных – no observed effect level) – 20 мг/кг массы тела и максимальный уровень суточного потребления (acceptable daily intake – ADI) – 0,1 мг/кг массы тела [11].

В результате проведенных Европейским агентством по безопасности пищевой продукции (EFSA) оценок рисков пулегона и 5 родственных ему по структуре веществ показано, что переносимая доза (TDI) пулегона составляет 0,1 мг/кг массы тела (м.т.) в сутки. Пулегон и ментофуран, вследствие их генотоксичности, не могут использоваться в качестве вкусоароматических веществ^{5 6} [11][12].

EFSA указало на необходимость дополнительных данных о генотоксичности пулегона (п-мента1,4(8)-диен-3-он, FL-№: 07.127), представляющего собой альфа-, бета-ненасыщенный кетон. EFSA разрешено использование в составе ароматизаторов изопулегола (№ FL: 02.067), изопулегона (№ FL: 07.067) и изопулегилацетата (№ FL: 09.219), несмотря на имеющиеся данные, указывающие на то, что изопулегон может частично изомеризоваться в пулегон⁷.

При изучении возможных негативных последствий, связанных с употреблением пулегона, в двухнедельном исследовании подопытным животным (крысам и мышам) внутрижелудочно вводили пулегон в составе кукурузного масла из расчета дозы 0, 37,5, 75, 150, 300 или 600 мг пулегона/кг массы тела для крыс и 0, 18,75, 37,5, 75, 150 или 300 мг пулегона/кг массы тела для мышей 5 дней в неделю в течение 16 дней. В трехмесячном исследовании крысам и мышам вводили 0, 9,375, 18,75, 37,5, 75 или 150 мг пулегона/кг массы тела животного 5 дней в неделю в течение 14 недель. В двухлетнем исследовании крысам и мышам вводили 0, 18,75 (только самцам крыс), 37,5, 75 или 150 (только мыши и самки крыс) мг пулегона/кг массы тела животного 5 дней в неделю в течение 104 недель. Результаты проведенных исследований указывают на токсическое действие, которое в определенных дозах оказывает пулегон на внутренние органы экспериментальных животных (табл. 2, 3) [5][13][14].

Международное агентство по изучению рака (IARC) классифицировало пулегон как вещество «возможно канцерогенное для человека» (потенциально способное вызвать рак) – группа 2В [5]. В дополнение к прямой токсичности, возникающей в результате воздействия пулегона, негативный эффект оказывают и его метаболиты, проявляя высокую гепатотоксичность.

Ментофуран – токсичный фуран-терпеноид, который также присутствует в растениях семейства Lamiaceae, является метаболитом пулегона и окисляется ферментами цитохрома P-450 до гепатотоксичных метаболитов, истощающих систему глутатиона.

Метаболизм ментофурана затрагивает ферменты цитохрома Р450 – CYP1A2, CYP2E1 и CYP2C19, которые окисляют его до 2-гидроксиментофурана, являющегося промежуточным звеном в образовании минтлактона и изоминтлактона. Метаболиты ментофурана, идентифицированные в микросомах печени человека и крысы и отвечающие за гепатотоксичность, представляют собой γ-кетоеналь и эпоксиды, образующиеся в результате окисления фуранового кольца [5][15].

Воздействие ментофурана на макроорганизм во многом схоже с воздействием пулегона. Для человека клинические признаки интоксикации характеризуются центрилобулярным геморрагическим некрозом печени, отеком легких, кишечным кровотечением и спазмами. Существуют сообщения о смертельных исходах. Подтверждено наличие гепатотоксичного эффекта. В отличие от пулегона, токсичность ментофурана не может быть снижена при помощи глутатиона [16].

При совместном изучении токсического действия структурно родственных монотерпенов пулегона и ментофурана было установлено, что ментофуран, являясь основным метаболитом пулегона, проявляет более высокую гепатотоксичность, чем пулегон, в печени экспериментальных животных (крыс). Пероральный прием пулегона в количестве 400 мг/кг и ментофурана в количестве 250 мг/кг один раз в день в течение 5 дней привели к значительному снижению уровней микросомального цитохрома P-450 и высокой гепатотоксичности у крыс. Однако при проведении 24-часового исследования на пяти прецизионных срезах тканей печени человека и расчете полумаксимальной эффективной концентрации (EC50) установлено, что пулегон является более токсичным для печени человека, чем ментофуран, так как EC50 для пулегона составила 4,0 г/мг ткани, для ментофурана – 5,8 г/мг ткани. При этом во всех прецизионных срезах наблюдалось снижении экспрессии miR-155-5p, что дает возможность рассматривать miR-155-5p в качестве биомаркера токсичности пулегона [17].

Туйон – бициклический монотерпеноидный кетон, присутствующий в виде двух изомеров – (S)-α-туйон и (R)-β-туйон. (S)-α-туйон является основным компонентом западного красного кедра (Thuja plicata Donn ex D. Don) (63,5–84,0 %), полыни (Artemisia genipi Weber ex Stechm.) (79,8 %), морской полыни (Artemisia aritime L.) (63,3 %), туи (Thuja occidentalis L.) (48,7–51,5 %), шалфея (Salvia officinalis L.) (13,1–48,5 %), полыни белой (Artemisia herba-alba Asso) (25,7–36,8 %), полыни африканской (Artemisia afra Jacq. Ex Willd.) (22,5 %) и полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) (11,4 %). (R)-βтуйон содержится в полыни (Artemisia genipi Weber ex Stechm.) (33,1–59,9 %), пижме (Tanacetum vulgare L.) (45,2 %), полыни большой (Artemisia arborescens L.) (34,0 %), шалфее (3,9–19,1 %), западном красном кедре (4,9–15,2 %), туе (3,14–9,9 %), белой полыни (2,0–9,0 %) и полыни африканской (8,9 %) [7].

α-Туйон более нейротоксичен, чем β-туйон. При пероральном приеме туйон может влиять на ЦНС и вызывать судороги, что говорит о том, что он может пересекать гематоэнцефалический барьер. Даже при низких дозах туйон может воздействовать на нервную ткань у крыс. Показано, что диастереомеры туйона ингибируют гамма-аминомасляную кислоту человека типа А (ГАМК)А), вызывая мышечные спазмы и судороги в дозе 5 мг/кг. CYP2A6, CYP3A4 и CYP2B6 метаболизируют α-туйон до 4- и 7-гидрокситуйона у людей. Было обнаружено, что α-туйон ингибирует CYP2A6 (концентрация полумаксимального ингибирования (IC50) = 2,34 мг/л) и CYP2B6 (IC50 = 2,66 мг/л), что может способствовать длительной и усиленной α-туйоновой токсичности. Переносимая доза (TDI) туйона составляет 0,01 мг/кг массы тела в сутки [11]. Прием масла шалфея и туи может вызывать судороги. Масло пижмы нейротоксично и также несет в себе риск возникновения судорог. Внутрижелудочное введение самкам швейцарских беременных мышей экстракта Artemisia herba-alba (внутрижелудочная фаза в 80 и 150 мг/кг) в течение всего периода гестации снижало фертильность, изменяло физическое развитие потомства, задерживало функцию памяти и нейромоторный рефлекс у потомства. Водный экстракт Artemisia herba-alba (при 300 мг/кг/сутки) вызвал снижение коэффициента фертильности самок крыс Sprague Dawley. Исходя из полученных сведений, следует избегать потребления богатых туйоном масел во время беременности [7].

Сведения о токсичности также были получены при изучении другой группы соединений – алкенилбензолов.

Токсиколого-гигиеническая характеристика алкенилбензолов, при определенных условиях оказывающих негативное влияние на здоровье человека.

Алкенилбензолы встречаются в качестве вторичных растительных метаболитов в различных травах и специях, например в базилике (Ocimum nudicaule Benth.), фенхеле (Foeniculum vulgare Mill.), эстрагоне (Artemisia dracunculus L.), корице цейлонской (Cinnamomum rigidissimum H.T.Chang), звездчатом анисе (Illicium verum Hook.f). Представителями данной группы соединений являются метилэвгенол, эстрагол, сафрол (табл. 4) [6][18–21].

Метаболические пути активации алкенилбензолов. Метаболические пути активации сафрола, метилэвгенола и эстрагола включают O-деалкилирование алкоксизаместителей в ароматическом кольце, эпоксилирование при двойной связи аллиловой боковой цепи и 1’-гидроксилирование аллиловой боковой цепи. 1’-гидроксиалкенилбензолы могут впоследствии быть сульфоконъюгированы. Полученные эфиры аллилового сульфата нестабильны и могут вступать в реакцию с клеточными нуклеофилами, такими как белки или ДНК, и в конечном счете инициировать и запускать серию токсических эффектов, включая белковые аномальные модификации, инактивацию ферментов, сшивку ДНК, образование иммуногенных видов, гибель клеток или онкогенную активацию. Токсикологическая значимость подчеркивается выводом о том, что введение ингибитора сульфотрансферазы (SULT) пентахлорфенола (PCP) резко снижает канцерогенную активность сафрола у грызунов. Кроме того, реакционноспособные сульфатные эфиры могут быть получены посредством конъюгации глутатиона с образованием производных меркаптурной кислоты. N-ацетил-S-[3’-(4-метоксифенил) аллил]-цистеин – меркаптурная кислота, образованная из 1’-сульфоксиэстрагола, была обнаружена в моче добровольцев после употребления чая из фенхеля, содержащего примерно 2 мг эстрагола [18][22][23].

Эстрагол. При проведении целого ряда исследований было показано наличие гепатоканцерогенного действия эстрагола при его пероральном введении мышам и крысам в дозах 150–600 мг/кг. Однако эти дозы в значительной степени превышают возможную наибольшую дозу его потребления в составе пищевых продуктов (0,05–50 мг/кг массы тела). Было также показано, что эстрагол либо не обладает мутагенной активностью, либо проявляет очень слабую мутагенную активность по отношению к S. typhimurium в тесте Эймса. Эстрагол и его метаболит 1’-гидроксиэстрагол способны к индукции синтеза ДНК в гепатоцитах крыс и мышей в условиях in vitro и in vivo при его введении в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг массы тела [16].

Присутствие эстрагола в чае из фенхеля (Foeniculum vulgare Mill.) подтверждено многочисленными исследованиями с использованием методов газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС). Эстрагол был обнаружен в качестве второстепенного компонента в количестве 0,8–4,1 % от общего количества летучих соединений. Согласно проведенным исследованиям, диапазон уровней содержания эстрагола в сухом фенхеле составил 0,15–13,3 мг/г, тогда как содержание эстрагола в настоях из фенхеля было значительно ниже – от 0,4 до 133,4 мкг/25 мл настоя, приготовленного из 1 г сухого материала, т. е. 0,016–5,34 мкг/мл. Определение эстрагола в инфузиях из различных широко используемых коммерческих травяных чаев на основе семян фенхеля показало, что уровни эстрагола находятся в пределах 50–250 мкг/л, в отдельных образцах достигают уровней 241–2058 мкг/л чая из чайных пакетиков. В чайных экстрактах из травяных чайных смесей типа фенхель-анис-тмин содержание эстрагола варьировалось от 4,0 до 76,7 мкг/л. При этом через час после употребление данного чайного экстракта содержание эстрагола в грудном молоке кормящих женщин составило 0,13 мкг/л. При ежедневном употреблении чая из фенхеля действие эстрагола оценивается в диапазоне 0,008–20,78 мкг/кг в день (младенцы), 0,25–5,04 мкг/кг в день (дети), 0,32–6,42 мкг/кг в сутки (женщины) и 0,15–2,93 мкг/кг в сутки (мужчины) [19][20].

Результаты различных исследований in vivo показали, что лечение мышей эстраголом или его метаболитом 1’-гидроксиэстраголом приводило к индукции опухолей печени. При этом мутагенные эффекты были более выражены после лечения метаболитом эстрагола. При внутрижелудочном введении эстрагола в количестве 600, 200, 66, 22 мг/ кг 5 дней в неделю в течение 4 недель самцам крыс линии gpt delta rat (F344) были установлены гепатотоксические эффекты, при этом из пяти крыс, получавших максимальную дозу эстрагола, количество выживших составило две особи [20][24].

При проведении исследований с использованием криоконсервированной клеточной линии человека HepaRG, после 24-часового воздействия эстрагола в концентрации 12,5 ммоль происходило быстрое снижение жизнеспособности клеток [25].

Метилэвгенол. Исследования травяных напитков, содержащих в своем составе имбирь (Zingiber officinale Rosc), гвоздику (Syzygium aromaticum L.), корицу (Cinnamomum burmannii Blume), фенхель (Foeniculum vulgare Mill.), перец бетель (Piper betle L.), бадьян (Illicium verum), мускатный орех (Myristica fragnan), лимонник (Cymbopogon), показали наличие метилэвгенола в количестве от 2,6 до 443,7 мкг/г в 49 из 114 образцов, закупленных в магазинах розничной торговли. Расчетное суточное потребление метилэвгенола составило от 0,1 до 2,7 мкг/кг массы тела в сутки [26].

LD50 (среднелетальная доза) при однократном пероральном введении мышам метилэвгенола составила от 810 до 1560 мг/кг массы тела. Он является генотоксичным канцерогеном в отношении различных систем организма при его поступлении в дозе 100 мг/кг массы тела. При введении метилэвгенола в дозе 300 мг/кг массы тела было отмечено снижение массы тела у самок и самцов мышей. При введении самцам мышей метилэвгенола в дозах 30, 100 и 300 мг/кг массы тела наблюдалось увеличение печени. У самок мышей увеличение печени наблюдалось при введении метилэвгенола в дозе 300 мг/кг массы тела. Отмечено увеличение случаев цитологических изменений, некроза тканей, подострых воспалений в тканях печени, гиперплазии желчного пузыря у самцов мышей, получавших метилэвгенол в дозе 1000 мг/кг массы тела. Для самок такие изменения наблюдались при введении метилэвгенола в дозе 300–1000 мг/кг массы тела. При пероральном введении метилэвгенола в количестве 30 мг/кг массы тела и более наблюдалось увеличение случаев атрофии, отеков, нарушений митотического деления и кисты в железистой ткани нижнего отдела желудка. Установлена доза метилэвгенола, не вызывающая заметных изменений в организме животных (NOEL) – 10 мг/кг веса в сутки [16]. При внутрижелудочном введении метилэвгенола в количестве 100, 300, 10 мг/кг в течение 91 дня самцам и самкам крыс линии gpt delta rat (F344) у всех особей были установлены гепатокарциногенные поражения [27].

В двухлетнем исследовании группам из 50 самок и 50 самцов мышей линии В3С3F внутрижелудочно вводился метилэвгенол в 0,5 % метилцеллюлозе в количестве 0 (контроль), 37, 75 и 150 мг/кг 5 дней в неделю в течение 105 недель. Метилэвгенол вызвал значительное увеличение заболеваемости гепатоцеллюлярной аденомой, карциномой и гепатобластомой у обоих полов, при этом наблюдался дозозависимый эффект. Вместе с тем зафиксирована одна карцинома желудка у самки и две нейроэндокринные опухоли у самцов мышей [28].

Сафрол. Многочисленные исследования показали, что введение сафрола экспериментальным животным (мыши и крысы) индуцировало опухоли и приводило к канцерогенным эффектам в печени и легких. Канцерогенный эффект был опосредован активными метаболитами – 1’-гидроксисафролом или 1’-сульфоксисафролом [20][28].

В микросомах печени человека сафрол активировался посредством CYP1А2 и продуцировал несколько реакционноспособных метаболитов, которые были идентифицированы как хинон и его таутомеры. Показано, что эти метаболиты опосредуют гепатотоксичность сафрола [4][29].

Так же как и пулегон, IARC относит метилэвгенол и сафрол к группе 2В – вещества «возможно канцерогенные для человека» (потенциально способные вызвать рак) [27][30].

Обсуждение. Монотерпенкетоны (пулегон, ментофуран, туйон) и алкенилбензолы (эстрагол, метилэвгенол, сафрол) в соответствии с техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 029/2012 «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» запрещены для использования при производстве пищевой продукции в качестве вкусоароматических веществ. Приложением 20 данного технического регламента утверждены максимально допустимые уровни содержания этих БАВ в составе пищевых продуктов, содержащих их за счет использования растительного сырья и ароматизаторов из растительного сырья. Аналогичные требования установлены в Европейском союзе⁸.

При этом ни на территории стран Таможенного союза Евразийского экономического союза, ни на территории стран Европейского союза не установлен гигиенический норматив содержания данных БАВ в БАД к пище на основе растительного сырья.

По результатам анализа данных о метаболизме пулегона в ментофуран, их взаимодействия с белками, приводящего к хронической регенеративной пролиферации клеток, которая может быть связана с канцерогенностью пулегона в печени и мочевом пузыре экспериментальных животных, Международное агентство по изучению рака (IARC) классифицировало пулегон как вещество «возможно канцерогенное для человека» (потенциально способное вызвать рак) – группа 2В. Метилэвгенол и сафрол также были отнесены к данной группе. Показаны риски здоровью при содержании в составе БАД к пище на растительной основе алкенилбензолов (эстрагола, метилэвгенола, сафрола).

Заключение. Представленные данные указывают на необходимость принятия мер по ограничению использования некоторых видов растений, содержащих высокие концентрации биологически активных веществ, оказывающих негативное воздействие на организм человека, установления гигиенических нормативов содержания этих веществ в составе БАД к пище на растительной основе с целью исключения возможных рисков для здоровья потребителей при использовании такой пищевой продукции в составе рациона.