Обнаружение вируса Западного Нила в зимующих комарах на территории Волгоградской области

Введение. Лихорадка Западного Нила (ЛЗН) – зоонозная трансмиссивная вирусная инфекция, вызываемая вирусом Западного Нила (ВЗН). В природе ВЗН поддерживается в энзоотичном цикле между птицами и кровососущими комарами (Diptera, Culicidae). Случайными (тупиковыми) хозяевами могут быть люди, лошади и другие млекопитающие. У человека ЛЗН протекает в виде острого лихорадочного заболевания с симптомами общей интоксикации, умеренного полиаденита, головными и мышечными болями, в ряде случаев с развитием серозного менингита и менингоэнцефалита [1]. На эндемичных по ЛЗН территориях с тропическим и субтропическим климатом циркуляция ВЗН может происходить круглогодично. В регионах с умеренным климатом передача вируса горизонтально позвоночным хозяевам происходит только летом и осенью. В настоящее время ВЗН – наиболее распространенный в Северной Америке и Европе патоген, переносчиками которого являются комары. По данным Референсцентра по мониторингу за возбудителем лихорадки Западного Нила в Российской Федерации, за период 1997–2020 гг. зарегистрировано 2964 случая заболевания лихорадкой Западного Нила в 35 субъектах. Механизмы поддержания ВЗН в межэпизоотический период и распространения инфекции весной на эндемичных территориях мало изучены. Особый интерес для исследователей представляют комары, которые переживают зимний период в состоянии диапаузы в различных убежищах. ВЗН в местных популяциях диапаузирующих Culex pipiens f. pipiens обнаружен в США в Нью-Йорке, Нью-Джерси и Пенсильвании [2–5]. Результаты исследований в долине Сакраменто в Калифорнии показали, что инфицированные самки рода Culex могут выживать в течение зимы и, возможно, передавать ВЗН по завершении диапаузы в конце зимы или ранней весной как вертикально, так и горизонтально [6]. В Европе РНК ВЗН у зимующих комаров Cx. pipiens обнаружена в Чехии, в регионе Южная Моравия [7]. На территории Российской Федерации подобных исследований не проводилось. Данные о возможности сохранения ВЗН у зимующих комаров в межэпизоотический период имеют большое значение для понимания циркуляции патогена на эндемичных территориях.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является оценка возможности сохранения вируса Западного Нила в комарах в межэпизоотический период в Волгоградской области. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: проведение скрининга на наличие РНК ВЗН и определение уровня инфицированности зимующих комаров, проведение углубленных молекулярно-генетических исследований генома возбудителя ЛЗН.

Материалы и методы. Сбор комаров проводился в г. Волгограде, Среднеахтубинском и Руднянском районах Волгоградской области в 2013–2021 гг. после осенних заморозков и в феврале – начале апреля (таблица). Диапаузирующих самок комаров собирали со стен и потолков погребов, овощехранилища, омшаника, колодцев с помощью аккумуляторного аспиратора (BioQuip Products) и стеклянной ловушки Кришталя (ООО «Химпром»). Пойманных комаров транспортировали в термоконтейнерах («Термо-Конт МК») с хладоэлементами в лабораторию, обездвиживали в морозильной камере при температуре –20 °С в течение 5–7 минут и определяли до вида по руководству А.В. Гуцевича [8] с помощью стереомикроскопа (Stemi 2000C, Carl Zeiss). Комаров одного вида фасовали на холоде от 2 до 30 особей в микроцентрифужные пробирки (Eppendorf,), которые хранили в морозильной камере при –80 °С. Затем готовили суспензии пулов комаров в физиологическом растворе и проводили выявление РНК вируса Западного Нила методом ОТ-ПЦР с использованием набора реагентов «АмплиСенс WNV-FL» (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией производителя. Установление генотипа ВЗН в положительных пробах проводили методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием 3 пар праймеров и 3 зондов (патенты РФ: № 2715625 от 02.03.2020; № 2715617 от 02.03.2020; № 2737396 от 30.11.2020). Комаров вида Cx. pipiens не подвергали анализу с целью выявления различий между внутривидовыми формами: f. pipiens и f. molestus.

Выделение вируса из проб пулов комаров, в которых была обнаружена РНК ВЗН, проводили с использованием культуры клеток Vero. Для этого клетки выращивали в среде DMEM (БиолоТ) с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma Aldrich, USA), 1 % L-глутамина (Gibco) и 1 % антибиотика/антимикотика (Sigma Aldrich) при 37 °С, 5,5 % СО2 и 70 % влажности. В качестве поддерживающей среды использовалась та же среда с добавлением 2 % эмбриональной бычьей сыворотки. Подготовленный монослой клеточной культуры Vero заражали пробами надосадочной жидкости суспензии комаров согласно классическому протоколу [9].

Для получения углубленной молекулярно-генетической характеристики геноварианта ВЗН, выявленного в зимующих комарах, из отфильтрованного клеточного супернатанта полученного вирусного изолята была выделена тотальная РНК, с которой и проводилась последующая работа по секвенированию. Метагеномное секвенирование образца проводили согласно методике Moser et al., 2016 [10], с авторскими изменениями на высокопроизводительном секвенаторе Illumina MiSEQ (Illumina Inc.). Анализ полученных данных осуществляли с помощью программных продуктов Cutadapt 2.9 [11], Samtools 1.9, Bcftools 1.9, bwa 0.7.17-r1188 [12] и SPAdes v3.11.1 [13], объединенных в конвейеры при помощи собственных скриптов, реализованных на языке Python 3. Для построения множественных выравниваний последовательностей геномов использовали MAFFT v7.271 [14]. Филогенетический анализ осуществляли с помощью программного пакета Mega X [15], для визуализации результатов использовали web-сервис iTOL [16].

Результаты. За период с 2013 по 2021 г. в Волгоградской области в зимовочных убежищах было собрано 4070 комаров: 3602 – Cx. pipiens, 468 – комплекса An. maculipennis. Места сборов, количество особей и результаты исследований на наличие РНК ВЗН зимующих комаров, собранных в Волгоградской области с 2013 по 2021 г., представлены в таблице. На наличие РНК ВЗН исследовано 136 пулов комаров вида Cx. pipiens и 21 пул – комплекса An. maculipennis. С 2013 по 2018 г. и в 2021 г. положительных на наличие РНК ВЗН пулов обнаружено не было. РНК ВЗН выявлена: в 1 пуле комаров вида Cx. pipiens и в 1 пуле комплекса An. maculipennis, собранных 02.04.2019 в погребе дачи СНТ «Колос», и 1 пуле комаров Cx. pipiens, собранных 26.02.2020 в погребе усадьбы на хуторе Сахарный. Оба зимовочных убежища расположены на территории Волго-Ахтубинской поймы в Среднеахтубинском районе области.

В результате вирусологического исследования трех проб пулов комаров, в которых была обнаружена РНК ВЗН, удалось получить вирусный изолят из одной (WNV Volgograd_о16/19).

Филогенетический анализ показал, что полученный изолят ВЗН, выделенный из пула зимующих комаров (Cx. pipiens, 02.04.2019), принадлежал ко второму генотипу вируса Западного Нила. Установлена его принадлежность к монофилетической кладе геновариантов ВЗН, выделенных на территории Волгоградской, Астраханской и Ростовской областей в 2007, 2018–2020 гг. (рис. 1).

Обсуждение. При исследовании инфицированности возбудителем ЛЗН позвоночных животных и членистоногих в 2013–2021 гг. на территории Волгоградской области РНК ВЗН выявлена в 13 из 914 проб органов диких птиц (1,42 %), в 1 из 1229 проб органов мелких млекопитающих (0,08 %), в 146 из 6820 проб кровососущих комаров (2,14 %) и 7 из 1996 проб иксодовых клещей (0,35 %). При исследовании сывороток крови домашних птиц и лошадей методом ИФА антитела к ВЗН обнаружены в 25 из 49 (51 %) и в 181 из 300 (60 %) исследованных проб соответственно. Эпизоотий ЛЗН среди птиц – основных резервуаров и лошадей – тупиковых хозяев в этот период не зарегистрировано. Основными резервуарами являются врановые и лимнофильные птицы, эффективными переносчиками – комары видов Culex pipiens и Culex modestus. Вероятно, при высокой дозе заражения второстепенными переносчиками могут являться комары видов Aedes vexans, Aedes caspius, Aedes dorsalis, массовый выплод которых происходит в пойменных водоемах в конце мая – июне.

Комары родов Anopheles и Culex зимуют на стадии имаго, и численность диапаузирующих самок к весне уменьшается более чем на 95 %. Рост популяций комаров этих родов в течение лета происходит постепенно, численность достигает максимума в конце июля – августе, т. е. в сезон передачи ВЗН. Комары рода Anopheles предпочитают питаться на млекопитающих, что ограничивает их роль в передаче ВЗН. Напротив, виды рода Culex, в частности Culex pipiens L. и Culex modestus Fic., распространенные в очагах ЛЗН на юге России, питаются как на птицах, так и на млекопитающих. Кроме того, комары Cx. pipiens и Cx. modestus более восприимчивы к ВЗН и способны к более эффективной передаче вируса, чем комары Aedes vexans, Aedes caspius, Aedes dorsalis. Приведенные данные позволяют считать именно комаров рода Culex основными переносчиками ВЗН на территории России [17]. В Волгоградской области имаго комаров комплекса An. maculipennis, неавтогенной формы Cx. pipiens (f. pipiens) и Cx. modestus зимуют в состоянии диапаузы в естественных и искусственных убежищах (рис. 2). В урбанизированных биотопах это могут быть погреба, колодцы, омшаники, в природных – пещеры, норы животных, различные укрытия в прикорневой части деревьев, тростника и т. п.

Поскольку большинство самок, которые входят в состояние диапаузы, не питаются кровью, их инфицирование ВЗН должно происходить посредством вертикальной передачи вируса. Неопровержимым доказательством того, что вертикально инфицированные осенью самки Сх. pipiens f. pipiens, пережившие зиму в состоянии диапаузы, способны следующей весной инициировать заражение, являются результаты исследований, проведенные в 2006 г. Anderson J.F. и Main A.J. [18]. Они описали горизонтальную передачу ВЗН инфицированной по вертикали самкой, находившейся в диапаузе более 5 месяцев, и пришли к выводу, что в умеренном климате передача ВЗН у Сх. pipiens f. pipiens от поколения к поколению является важным средством, позволяющим вирусу сохраняться в зимний период и в последующем вызывать эпизоотии в весенне-летний период. Вероятно редко может также осуществляться и альтернативный механизм, при котором самки перед наступлением диапаузы питаются инфицированной кровью, переживают зиму и передают ВЗН весной [19].

При исследовании 157 пулов комаров, собранных в зимовочных убежищах Волгоградской области в период с 2013 по 2021 г., в 3 пулах обнаружена РНК ВЗН. Общий уровень инфицированности зимующих в Волгоградской области комаров составил 1,9 %. Аналогичный показатель при исследованиях в Нью-Йорке составил 0,1 % [2], в Южной Моравии – 0,5 % [7]. Выявление РНК ВЗН и получение вирусного изолята (WNV Volgograd_о16/19) из зимующих комаров может указывать на возможность длительного сохранения вируса в комарах в межэпизоотический период на эндемичных по ЛЗН территориях Российской Федерации. Типирование ВЗН методом ОТ-ПЦР позволило установить наличие второго генотипа в одном из трех положительных пулов зимующих комаров.

Наши исследования подтверждают предположение о том, что циркуляция ВЗН второго генотипа на эндемичных территориях юга европейской части России поддерживается за счет местной популяции вируса, существующей уже довольно продолжительное время. Так, специалистами Референс-центра по мониторингу за возбудителем ЛЗН получены последовательности геномов 11 изолятов ВЗН из образцов полевого и клинического материала в 2019 г. (4 – все из Волгоградской области) и полевого материала в 2020 г. (2 – Астраханская область, 4 – Волгоградская область, 1 – Ростовская область). Филогенетический анализ показал, что все секвенированные изоляты принадлежат ко второму генотипу ВЗН и формируют отдельную кластерную группу, генетически разобщенную со штаммами вируса, выявленными в аналогичный период времени на территориях стран Центральной Европы, Балканского и Средиземноморского регионов. Топология филогенетического дерева указывает на наличие ближайшего единого общего предка у выделенных изолятов ВЗН второго генотипа, существовавшего не позднее 2007 г. Это подтверждают и данные сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей, показавшие у всех изолятов 2018–2020 гг. сходный специфический характер аминокислотных замен, затронувших в основном неструктурные гены. Предположение, что вирусная популяция периодически привносится на данные территории, в настоящее время не находит подтверждения, хотя и не может быть полностью исключено ввиду малого числа исследованных изолятов [20].

Заключение. В Волгоградской области впервые ВЗН обнаружен у зимующих комаров. Результаты этих исследований подтверждают гипотезу о персистенции ВЗН второго генотипа у комаров в течение межэпизоотического периода и возможности передачи ВЗН от комара к птице в весенний период как одного из механизмов формирования местных очагов без ежегодного заноса вируса на эндемичных по ЛЗН территориях Российской Федерации. Однако необходимы дальнейшие исследования резервуаров и переносчиков для углубленного анализа циркуляции ВЗН в Российской Федерации.