К механизму формирования аутоиммунных патологий, обусловленных воздействием инактивированных Mycobacterium tuberculosis

Введение. Мировые процессы глобализации и интеграции привели к обострению множества медицинских проблем, среди которых одной из приоритетных является туберкулез – заболевание, обусловливающее, по данным ВОЗ, смертность 1,5 миллиона людей в год [1]. Общая заболеваемость туберкулезом во всем мире составляет 10 млн человек ежегодно. Факторами, значительно усугубляющими характер течения болезни, являются сочетание ее с другими социально значимыми инфекциями (ВИЧ, гепатиты, сифилис и др.) [2][3], формирование множественной (широкой) лекарственной резистентности [4][5], что значительно модифицировало классический патоморфоз и определило его новые особенности – доминирование экссудативно-некротических процессов, развитие инфильтративных форм с массивным распадом тканей и образованием гигантских каверн, наличие выраженных признаков казеозной пневмонии и пр. [6–9]. В Российской Федерации на протяжении 12-летнего периода отмечается неуклонное снижение заболеваемости туберкулезом. В 2019 году показатель заболеваемости составил 41,8 на 100 тыс. населения, наиболее высокая заболеваемость активным туберкулезом продолжает регистрироваться в Сибирском, Дальневосточном и Уральском округах. Причинами неблагополучной эпидемиологической ситуации в субъектах РФ с наиболее высокими показателями заболеваемости являются интенсивные миграционные процессы, несвоевременное направление больных к специалистам-фтизиатрам, недостаточный объем мероприятий по профилактическому осмотру, низкий социально-экономический уровень проживания больных¹. Факторами, способствующими распространению инфекции, являются наличие резервуаров возбудителя M. tuberculosis в местах лишения свободы, а также среди сельскохозяйственных животных [10]. Высокая устойчивость туберкулезных микобактерий к внешним условиям обеспечивает им сохранность в почвенной среде, воде (морской, пресноводной, водопроводной, плавательных бассейнов), животноводческих кормах, на поверхности плодовоовощных культур, в домашней и больничной пыли, в местах жизнедеятельности человека и обитания животных [11–15]. Сопутствующие туберкулезу патологии обусловлены воздействием компонентов бактериальной стенки M. tuberculosis, обладающих высокой антигенной активностью, и, способных индуцировать множественные нарушения в организме воспалительного характера. Так, введение теплокровным животным полного адъюванта Фрейнда, представляющего собой водно-масляную эмульсию термически обработанных туберкулезных микобактерий, приводит к разнородным по клиническим проявлениям аутоиммунным заболеваниям, в числе которых ревматоидный артрит, миокардит, энцефаломиелит и др. [16–19]. Раскрытие механизмов воздействия инфекта на организм человека способствует разработке более эффективных способов профилактики и лечения социально значимого заболевания, что определяет актуальность изучения нарушений здоровья, связанных с воздействием M. tuberculosis на иммунную систему и аутоиммунитет.

Цель исследования – изучение этиопатогенеза аутоиммунных нарушений, ассоциированных с воздействием на организм теплокровных животных термически инактивированных M. tuberculosis.

Материалы и методы. Эксперимент выполняли на старых (более 400 г) 16 самцах крыс линии Вистар, разделенных на две равные группы. Крысам опытной группы под общим наркозом (Золетил, Франция) вводили в правую заднюю конечность п/к эмульсию туберкулезных бактерий в форме полного адъюванта Фрейнда (АФ) в объеме 0,1 мл на 200 г массы тела животных. Крысам контрольной группы по той же схеме вводили физиологический раствор.

По истечении 1, 3 и 7 недель у животных под общим наркозом из сердца отбирали кровь, в которой определяли следующие параметры: количество лейкоцитов, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), активность ферментов в митохондриях лимфоцитов – лактатдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы.

Общее количество лейкоцитов подсчитывали под микроскопом, используя камеру Горяева, при малом увеличении 10 × 10. Препараты готовили стандартным способом, используя для окраски ядер лейкоцитов 100 мл 5 % раствор уксусной кислоты и 1 мл 1 % раствора метиленового синего. СОЭ измеряли по стандартному методу Панченкова за период времени 1 ч. Для этого использовали капилляр Панченкова со шкалой от 0 до 100 мм и 5 % раствор цитрата натрия в качестве антикоагулянта.

Активность митохондриальных ферментов определяли цитобиохимическим методом [20], предложенным Кондрашовой М.Н. и соавт. Для этого 10 мкл крови наносили на предметные стекла и с помощью прибора Microscopy Vision (Австрия) готовили мазки. Полученные препараты высушивали и фиксировали в 60 % растворе ацетона в течение 30 с и ополаскивали дистиллированной водой. Активность СДГ определяли как разницу показателей (№ 1 – № 2) интенсивности окраски гранул, полученных при инкубировании клеток крови в растворах следующего состава (рН 7,2 ± 0,01 при t = 37 °C): № 1 – 125 ммоль/л KCl, 10 ммоль/л HEPES, 1 мг/мл нитросинего тетразолия окисленного (НСТ) и 5 ммоль/л янтарной кислоты; № 2 – 125 ммоль/л KCl, 10 ммоль/л HEPES, 1 мг/мл НСТ и 5 ммоль/л малоновой кислоты, используемой в качестве селективного ингибитора СДГ. Активность ЛДГ определяли путем инкубации мазков крови в среде следующего состава (рН 7,2 ± 0,01 при t = 37 °C): 125 ммоль/л KCl, 10 ммоль/л HEPES, 1 мг/мл НСТ, 5 ммоль/л молочной кислоты, 5 ммоль/л малоновой кислоты, 0,5 ммоль/л НАДН. После инкубации (СДГ, ЛДГ) стекла промывали дистиллированной водой, высушивали и окрашивали в 0,05 % растворе нейтрального красного, имеющего сродство к ядрам клеток. Препараты микроскопировали при увеличении 10 × 100 под масляной иммерсией. На каждую крысу исследовалось по 100 клеток, которые для рандомизации отбирались из трех зон стекла: начальной, средней и финишной. Препараты фотографировали и обрабатывали в программе Bio Images (г. Пущино), позволяющей рассчитывать площадные (объемные) характеристики клеток и их компартментов, а также вычислять количество образуемого маркера дыхательной активности митохондрий – диформазана.

Рентгеновские снимки были получены на стационарном ветеринарном аппарате Ecoray Ultra 300V (Корея).

Рассчитывали среднее значение, стандартную ошибку среднего. Проверка нормальности распределения данных осуществлялась по критерию Шапиро – Уилка и при позитивном заключении сравнение гипотез проводилось по критерию Стьюдента в программе Microsoft Excel. Значимыми считались различия при p ≤ 0,05.

Результаты. Введение животным АФ сопровождалось иммунным ответом организма, который проявлялся в виде колебаний в крови численности лейкоцитов (рис. 1).

Из графика следует, что воспалительный процесс, обусловленный введением АФ, протекал волнообразно с максимумом на третьей неделе – количество лейкоцитов при этом возрастало на фоне контрольных значений с 9,8 до 11,3 тыс./мкл. К седьмой неделе отмечался плавный спад и содержание лейкоцитов в периферической крови возвращалось к норме (крайний столбец справа).

Косвенным доказательством протекания воспалительных реакций в организме служит тест на определение СОЭ. Тесная корреляция между содержанием белков острой фазы и показателем СОЭ позволяет сделать заключение об активации защитно-приспособительного процесса в виде общего воспаления, сохраняющегося на протяжении всего эксперимента у животных опытной группы (рис. 2).

Для животных опытных групп оказалось характерным неравномерное сужение суставных щелей, перестройка костной структуры в межвертельной области, где обнаруживаются участки кистовидных просветлений и остеосклероза (рис. 3, а, б). Суставные поверхности в коленных суставах уплощены. В ряде случаев контуры для вертлужной впадины не определяются. У одного животного (рис. 3, а) отмечена резорбция костной ткани, в результате которой произошло рассасывание головки и шейки бедренной кости (справа). У животных контрольной группы грубых изменений в костно-мышечной структуре не выявлено (рис. 3, в, г).

На рис. 4 представлены результаты молекулярных исследований воздействия инфекта на активность лактатдегидрогеназы иммунных клеток организма.

Из рисунка видно, что к окончанию первой недели эксперимента активность энергообеспечивающего фермента достоверно снижается у животных опытной группы относительно контрольной на 28 %. С развитием аутоиммунной патологии скорость гликолиза, протекающего внутриклеточно, неуклонно уменьшается и к седьмой неделе разница с контролем достигает 40 % (р = 0,003).

Активность одного из ключевых комплексов клеточного дыхания – сукцинатдегидрогеназы, осуществляющего перенос электронов на энергосопрягающих мембранах митохондрий, отражена в динамике на рис. 5.

Из рисунка видно, что уже к окончанию первой недели после контаминации животных каталитическая активность оксидоредуктазы повышается на 28 % относительно контрольной группы. Следующий за этим спад окислительного фосфорилирования, обусловленный дезактивацией встроенной в митохондриальную мембрану СДГ, приводит к снижению интенсивности клеточного дыхания в 4,3 раза (р = 0,029) и, как следствие, к энергодефициту иммунокомпетентных клеток в условиях формируемой патологии.

Динамика объема лимфоцитов, играющих центральную роль в осуществлении клеточного иммунитета, представлена на рис. 6.

Из рисунка видно, что средний объем иммунокомпетентных клеток у контрольных животных значительно не изменяется во времени и колеблется в пределах физиологической нормы 340–370 мкм³. При гиперстимуляции иммунной системы инактивированными M. tuberculosis отмечается микроцитоз, выраженность которого максимальна на третьей неделе, а сравнение с интактными животными выявляет различия в 40 % (р = 0,0004).

Обсуждение. Предложенный в 1930 г. Ю. Фрейндом адъювант находит широкое применение в практике лабораторного эксперимента, несмотря на то что механизм его действия раскрыт далеко не полностью [21]. Антигенная стимуляция термически обработанными микобактериями (M. tuberculosis) организма теплокровных животных приводит к дифференцировке лимфоцитов по пути Th1 и характеризуется гиперчувствительностью замедленного типа к аутоантигенам [22]. Генерализация воспалительного процесса вследствие аутоиммунных реакций сопровождается поражением различных органов, в том числе и соединительной ткани. Выявленный случай остеохондропатии головки бедренной кости (рис. 3, а) с деградацией костной ткани определяет костно-мышечную систему в качестве мишени для опосредованного воздействия инфекта.

Согласно полученным результатам, одну из молекулярных основ патогенеза M. tuberculosis-индуцированного аутоиммунного заболевания составляют нарушения, ассоциированные с дисбалансом выработки энергии в лимфоцитах. Прогрессирующее заболевание сопровождается энергодефицитом за счет снижения активности процессов гликолиза в цитозоле клетки и инактивации II дыхательного комплекса электрон-транспортной цепи митохондрий – СДГ. Недостаток энергии может являться причиной выявленного микроцитоза лимфоцитов, минимальный объем которых зарегистрирован на 3-й неделе с момента введения животным АФ. С другой стороны, в этот же период отмечен патологический лейкоцитоз (рис. 1). Продуцирование энергонеобеспеченных иммунокомпетентных клеток может служить причиной их функциональной несостоятельности и обеспечивать повышенную агрессивность аутоиммунных реакций.

Экспериментально выявленные молекулярно-клеточные звенья патогенеза позволяют рекомендовать включение в схемы профилактики и лечения туберкулеза препараты с иммуномодуляторным, антигипоксантным и остеопротекторным механизмом действия для повышения эффективности проводимой терапии.

Выводы

1. Механизм иммунотоксического действия термически инактивированных M. tuberculosis связан с нарушением энергообеспечения в клетках иммунной системы и ингибированием ЛДГ на 40 % у животных опытной группы относительной контрольной, СДГ на 77 % и снижением объема лимфоцитов на 27–40 %.

2. Одной из основных мишеней опосредованного через иммунную систему действия инфекции является опорно-двигательный аппарат, что подтверждается рентгенологически резорбцией к 7-й неделе с момента интоксикации головки и шейки бедренной кости у теплокровных.