К вопросу обоснования максимальных недействующих концентраций полициклических ароматических углеводородов в крови детей и подростков по критериям их гормонального профиля

Введение. Одной из основных задач социальной политики Российской Федерации является сохранение населения, укрепление здоровья и повышение благополучия людей¹. Современный подход к решению этой задачи основан на методологии анализа риска для здоровья человека, в рамках которой большое внимание уделяется биологическим маркерам, отражающим факт воздействия (экспозиции) и развития эффектов в виде негативных ответных реакций [1].

Полициклические ароматические углеводороды (полиарены, ПАУ) – стойкие органические загрязнители окружающей среды, эндокринные дизрапторы, представляют собой группу органических соединений, состоящих из двух и более конденсированных бензольных колец. Основным источником поступления смеси ПАУ в атмосферный воздух являются высокотемпературные процессы антропогенного и природного происхождения (промышленное производство, сжигание органического топлива, выбросы автотранспорта, приготовление пищи, табакокурение, лесные пожары, вулканическая активность и др.) [2].

Повсеместное присутствие смеси ПАУ в атмосферном воздухе представляет потенциальную угрозу для здоровья человека. Хроническое воздействие низкомолекулярных ПАУ на человека происходит ингаляционным путем. Согласно зарубежным исследованиям, действие ПАУ на человека связано с повышенным уровнем заболеваний, сахарным диабетом, эндокринными расстройствами [3–7].

Щитовидная железа – ключевой орган эндокринной платформы человека. Гормоны трийодтиронин (Т3), тетрайодтиронин (тироксин, Т4), вырабатываемые щитовидной железой, влияют на обмен веществ, функционирование нервной, сердечно-сосудистой и репродуктивной систем, оказывают влияние на рост и развитие [8–9]. Исследования in vitro показали, что ПАУ и гидроксипроизводные ПАУ взаимодействуют с рецептором гормонов щитовидной железы, с белками, транспортирующими тиреоидные гормоны, и ферментами, участвующими в синтезе и инактивации гормонов щитовидной железы [10–12]. Автор Peng F. и соавт. в исследованиях на животных показали, что ПАУ оказывают влияние на уровень гормонов щитовидной железы, различные ПАУ и их гидроксипроизводные могут проявлять агонистическую и антагонистическую активность по отношению к продукции гормонов [13]. Автор Yang Z. и соавт. при изучении зависимости объема щитовидной железы от содержания гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов (ОН-ПАУ) в моче обнаружили, что увеличение объема щитовидной железы положительно связано с повышением суммарной концентрации OH-ПАУ в моче [14]. Автор Amber L. и соавт. при оценке связи между содержанием гидроксилированных ПАУ (ОН-ПАУ) в моче и гормонов в сыворотке крови беременных установили положительную ассоциацию между ОН-ПАУ и гормоном T3 и соотношением T3 к T4 [15]. Автор Sobhani P. и соавт. в результате изучения связи метаболитов ПАУ в моче с уровнем гормонов щитовидной железы у детей и подростков обнаружили значительную положительную корреляцию между метаболитами ПАУ в моче и ТТГ в крови (P < 0,05). Автор предположил, что длительное воздействие ПАУ может привести к нарушению функции щитовидной железы [16].

Таким образом, уровень гормонов щитовидной железы в крови может быть применен для оценки эндокринных нарушений в условиях аэрогенной экспозиции полициклическими ароматическими углеводородами. В настоящее время опубликованные работы касаются изолированного или одновременного комбинированного воздействия смесей ПАУ на население, но отсутствуют данные о максимальных допустимых концентрациях ПАУ в крови детей.

Цель исследований – изучение зависимостей уровня гормонов щитовидной железы от концентрации полициклических ароматических углеводородов в крови, обоснование их максимальных недействующих концентраций в крови детей и подростков по критериям тиреоидного профиля.

Материалы и методы. В рамках пилотного проекта в период 2022–2023 гг. проведен анализ полициклических ароматических углеводородов (нафталин (С₁₀Н₈, CAS № 91-20-3), 2-метилнафталин (C₁₁H₁₀, CAS № 91-57-6), антрацен (С₁₄Н₁₀, CAS № 120-12-7), 9-метилантрацен (C₁₅H₁₂, CAS № 779-02-2), пирен (C₁₆H₁₀, CAS № 129-00-0), бенз(а)пирен (C₂₀H₁₂, CAS № 50-32-8) в атмосферном воздухе на селитебных территориях вблизи расположения предприятий черной и цветной металлургии (территория наблюдения) и на условно чистой селитебной территории с отсутствием металлургических и других промышленных предприятий (территория сравнения) проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием (ВЭЖХ/ФЛД). Нижний предел обнаружения ПАУ при отборе разовых проб воздуха составляет 0,00004–0,0001 мкг/м³ с погрешностью определения не более 25 %. Среднесуточные концентрации ПАУ в воздухе рассчитывали как среднее арифметическое разовых проб, отобранных в течение суток.

С целью обоснования максимальных недействующих концентраций ПАУ проведены химико-аналитические и клинико-лабораторные исследования образцов крови детей и подростков в возрасте 4–14 лет (n = 81), проживающих в условиях аэрогенных экспозиций (n = 59) и на условно чистой территории (n = 22).

Изучение зависимостей (y = b₀x + b₁) уровня гормонов и антител в сыворотке крови детей и подростков от концентрации ПАУ в крови проводили методом регрессионного анализа.

Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (выписка из протокола заседания № 4 от 24.02.2022). От каждого законного представителя ребенка, включенного в выборку, получено письменное добровольное информированное согласие на добровольное участие в биомедицинском исследовании.

В качестве маркеров экспозиции определяли содержание в крови полициклических ароматических углеводородов (нафталин, 2-метилнафталин, антрацен, 9-метилантрацен, пирен, бенз(а)пирен) методом ВЭЖХ/ФЛД на жидкостном хроматографе (Shimadzu, Япония) в соответствии с методикой ФР.1.31.2024.48308. Степень извлечения ПАУ из образцов крови способом жидкостной экстракции ацетонитрилом в присутствии высаливателя с предварительным подщелачиванием проб составляет от 78 % для бенз(а)пирена до 95 % для антрацена. Диапазон измеряемых концентраций нафталина в крови составляет 0,0001–0,01 мкг/см³, 2-метилнафталина 0,00005–0,005 мкг/см³, антрацена и 9-метилантрацена 0,000005–0,0016 мкг/см³, пирена 0,000025–0,011 мкг/см³, бенз(а)пирена 0,000005–0,0019 мкг/см³. Относительная погрешность измерения 30–32 %. Обработку результатов хроматографического анализа проводили с применением программного продукта LabSolution (Shimadzu, Япония). Отбор и анализ биологических проб проводился в период с февраля по май 2023 г.

В качестве маркеров ответа при ингаляционном поступлении полициклических ароматических углеводородов изучены показатели тиреоидного статуса у детей и подростков (содержание свободного тетрайодтиронина (тироксин, Т4 свободный), тиреотропного гормона (ТТГ), антител к тиреопероксидазе (АТ к ТПО), антител к тиреоглобулину (АТ к ТГ) в сыворотке крови) методом иммуноферментного анализа с использованием фотометра Elx808IU (BioTek, США)². Содержание йода в моче определяли церий-арсенитовым методом на спектрофотометре СФ 5400-ПЭ, (Экрос, Россия) [17]. В качестве физиологической нормы содержания тироидных гормонов и антител в сыворотке крови приняты значения, рекомендуемые в используемых для их определения тестах ООО «ХЕМА»², физиологическая норма уровня йода в моче не менее 10 мкг/см³ [18]. Исследования проведены в период с февраля по май 2023 г.

Обоснование маркеров ответа выполняли по расчету отношения шансов (Odds Ratio, OR), характеризующего связь между концентрацией ПАУ в крови и вероятностью отклонения маркера ответа от нормы. Критерием наличия связи принимали условие OR > 1³.

Установление параметров зависимости показателя отношения шансов от концентрации ПАУ в крови проводили методом построения регрессионной модели в виде экспоненциальной функции OR = e^a0–a1x, где OR – эпидемиологический показатель, характеризующий связь ответа с воздействием; x – концентрация ПАУ в крови, мкг/см³; a₀, a₁ – параметры модели, определяемые методом регрессионного анализа. Достоверность полученной модели оценивали при проведении однофакторного дисперсионного анализа по критерию Фишера (F).

Максимальную недействующую концентрацию определяли исходя из условия OR = 1. В качестве максимальной недействующей концентрации принимали величину, соответствующую верхней 95 % доверительной границе полученной модели при OR =1³.

Статистическую обработку полученных данных проводили в 2024 г. с использованием программных продуктов, разработанных специалистами отдела математического моделирования систем и процессов ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения». Качество полученных моделей оценивалось с использованием коэффициента детерминации (R²) и критерия Фишера (F > 3,63). Значимость зависимостей оценивалась по критерию Стьюдента при p ≤ 0,05.

Ограничения исследования. В рамках пилотного проекта приведены результаты исследований концентраций тиреотропных гормонов и антител только для 59 детей, проживающих в селитебной зоне предприятия, и 22 детей в регионе сравнения. При этом не обсуждалось биологическое значение исследуемых показателей «антитела к тиреопероксидазе» и «антитела к тиреоглобулину», гормонов в сыворотке крови. Исследование проводилось в период с февраля по май 2023 года. В другие периоды года гормональный статус детей не оценивался. В дальнейших исследованиях будут учтены возрастные нормы для исследуемых в данном проекте показателей с уточнением сезонности года.

Результаты. Анализ ПАУ в атмосферном воздухе на территориях сравнения и наблюдения показал отсутствие превышений максимально разовых и среднесуточных предельно допустимых концентраций (ПДК)⁴ по всем изучаемым соединениям. Вместе с тем на территории наблюдения при разовых отборах обнаружено присутствие нафталина, 2-метилнафталина пирена и бенз(а)пирена в 100 % проб в диапазоне концентраций 0,00014 · 10^–3 … 0,00075 · 10^–3 мг/м³, антрацена и 9-метилантрацена в 25 % проб на уровне нижнего предела обнаружения при разовых отборах 0,00007 · 10^–3 мг/м³. На территории сравнения обнаружены пирен и бенз(а)пирен в 25 % проб в диапазоне концентраций 0,00008 · 10^–3 … 0,00013 · 10^–3 мг/м³. Среднеарифметические значения среднесуточных концентраций ПАУ в атмосферном воздухе территорий наблюдения и сравнения, рассчитанных по результатам анализа разовых проб, представлены в табл. 1. Достоверно более высокие концентрации (р < 0,05) определяемых соединений установлены на территории расположения предприятий металлургической промышленности (территория наблюдения) в 1,7–2,8 раза. Из всех полиароматических углеводородов ориентировались на наименьшую концентрацию, которая будет гарантировать безопасность атмосферного воздуха для здоровья населения, в т. ч. и для детского.

В табл. 2 приведены среднегрупповые концентрации полициклических ароматических углеводородов, обнаруженных в образцах крови детей и подростков групп наблюдения и сравнения (M ± m). В группе наблюдения обнаружены все определяемые ПАУ в диапазоне концентраций от 0,00001 до 0,00681 мкг/см³, присутствующие в 11,8–98,3 % от всех проанализированных проб (n = 59). В группе сравнения обнаружены 3 из 6 определяемых аналитов в диапазоне концентраций от 0,000005 до 0,00031 мкг/см³, присутствующих в 81,8–95,4 % от общего количества проб (n = 22). В группе наблюдения максимальная среднеарифметическая концентрация обнаружена для пирена (0,00137 ± 0,00037) мкг/см³, минимальное содержание (0,0000044 ± 0,0000033) мкг/см³ – для бенз(а)пирена. В группе сравнения максимальная среднеарифметическая концентрация в крови (0,000138 ± 0,000041) мкг/см³ установлена по пирену, минимальная (0,00001 ± 0,000003) мкг/см³ – по антрацену.

Чаще других и в более высоких концентрациях, присутствующим в образцах крови детей и подростков в группах наблюдения и сравнения, обнаружен пирен, что согласуется с результатами аналогичных исследований [19][20]. В целом установлено достоверно более высокое (p < 0,05) содержание антрацена в 3,5 раза, 9-метилантрацена в 5 раз и пирена в 9,9 раза в крови детей и подростков в группе наблюдения по отношению к группе сравнения. Нафталин, 2-метилнафталин и бенз(а)пирен в крови детей группы сравнения не обнаружены ни в одной пробе.

В табл. 3 представлены результаты исследований тиреоидного статуса (ТТГ, Т4 свободный, АТ к ТГ, АТ к ТТГ), а также йодной обеспеченности (йод в моче) у детей и подростков и нормативные значения данных показателей по возрастным группам, представленных в источнике².

В группе наблюдения установлено более высокое в 1,1–1,4 раза по сравнению с нормой содержание ТТГ у 15 % обследованных детей, диапазон концентраций составил 1,04–5,47 мкМЕ/см³; определено более низкое по сравнению с нормативным показателем в 1,2–3,4 раза содержание йода в моче в 77,8 % проб, диапазон концентраций составил 2,93–13,54 мкг/100 см³. В группе сравнения содержание ТТГ в крови детей выше физиологической нормы в 1,06–1,3 раза установлено в 7,5 % проб, содержание на уровне 0,41–6,88 мкМЕ/см³; определено более низкое в 1,3–1,4 раза содержание йода в моче по отношению к норме в 55 % проб в диапазоне обнаруженных концентраций 6,97–22,33 мкг/100 см³. По остальным показателям полученные значения определены в пределах нормативных рамок.

Сравнение показателей в изучаемых группах детей показало достоверно более высокое (р < 0,05) содержание гормона Т4 свободного в сыворотке крови детей группы наблюдения в 1,2 раза. По остальным показателям достоверных различий между группами наблюдения и сравнения не установлено.

С целью выявления приоритетных для детального исследования причинно-следственных связей проведен предварительный регрессионный анализ зависимостей (y = b₀x + b₁) между содержанием индивидуальных ПАУ в крови и уровнем гормонов и антител в сыворотке крови детей и подростков. Анализ достоверности полученных аппроксимаций показал статистически значимые модели зависимости повышения концентрации ТТГ от повышения содержания в крови нафталина (R² = 0,19; F = 6,65; р < 0,05), 2-метилнафталина (R² = 0,22; F = 11,3; р < 0,01), антрацена (R² = 0,19; F = 8,20; р < 0,01) и пирена (R² = 0,13; F = 5,24; р < 0,05). Повышение содержания гормона Т4 свободного в сыворотке крови связан с увеличением концентрации в крови нафталина (R² = 0,14; F = 6,74; р < 0,05) и 2-метилнафталина (R² = 0,17; F = 7,62; р < 0,01). Повышение количества антител к тиреоглобулину в сыворотке крови связано с повышением концентрации в крови 2-метилнафталина (R² = 0,54; F = 10,73; р < 0,01), антрацена (R² = 0,48; F = 11,21; р < 0,01), 9-метилантрацена (R² = 0,30; F = 4,77; р = 0,05), пирена (R² = 0,49; F = 9,43; р < 0,05), при повышении концентрации нафталина в крови содержание АТ к ТГ в сыворотке снижается (R² = 0,30; F = 5,17; р < 0,05). Повышение количества антител к тиреоидной пероксидазе в сыворотке зависит от увеличения концентрации нафталина в крови (R² = 0,65; F = 18,7; р < 0,01). Снижение числа АТ к ТПО в сыворотке зависит от повышения содержания 9-метилантрацена (R² = 0,31; F = 5,04; р < 0,05) и пирена (R² = 0,44; F = 6,30; р < 0,05) в крови. Анализ содержания йода в моче в зависимости от концентраций ПАУ в крови выявил тенденцию к понижению концентрации йода с повышением всех изучаемых ПАУ в крови, что свидетельствует о недостатке в организме микроэлемента, необходимого для синтеза тироксина. Статистически значимые зависимости не установлены.

По критерию содержания ТТГ в сыворотке крови установлены максимальные недействующие концентрации для нафталина, антрацена и пирена в образцах крови детей и подростков в возрасте 4–14 лет (табл. 4).

Отношение шансов повышения содержания ТТГ в сыворотке с увеличением концентрации нафталина, антрацена, пирена в крови описывается уравнениями вида OR = ^{e-2,97–0,003х}, OR = ^{e-2,10–14903х} и OR = ^{e-2,31–3172х} соответственно. Установлена 95 %-я верхняя доверительная граница максимальных недействующих концентраций нафталина, антрацена и пирена в крови, которая составила 0,000178; 0,000020 и 0,000808 мкг/см³ соответственно. На рисунке показана зависимость показателя отношения шансов (OR) повышения уровня ТТГ с увеличением концентрации пирена в образцах крови обследуемой группы детей.

Обсуждение. В период иследований превышений ПДК ПАУ в атмосферном воздухе не установлено, вместе с тем их совместное действие дает эффективность на изменение показателей щитовидной железы. Точный механизм действия ПАУ на щитовидную железу недостаточно изучен. В целом в исследованиях, изучающих связь воздействия ПАУ на уровень гормонов щитовидной железы среди населения, получены различные результаты корреляций в зависимости от состава определяемых в биологических средах (кровь, моча) ПАУ (маркеров экспозиции), возраста, пола и ряда других показателей. Так, результаты исследований Yang S. и соавт. по изучению связей между содержанием метаболитов ПАУ в моче и уровнем гормонов щитовидной железы у подростков и взрослых показали, что у подростков комбинированное воздействие 8 метаболитов ПАУ отрицательно коррелировало с ТТГ, а корреляции ПАУ – ТГ были противоречивыми между подростками и взрослыми [21].

В представленном исследовании по определению содержания индивидуальных ПАУ в образцах крови детей и подростков наблюдалось преобладание пирена над другими соединениями данной химической группы (2-метилнафталина, нафталина, антрацена, 9-метилантрацена, бенз(а)пирена). Полученные результаты согласуются с аналогичными показателями, представленными в публикациях [21][22].

В зарубежных источниках опубликованы отдельные данные о связи между содержанием ПАУ в крови, нарушающих работу эндокринной системы, с уровнем гормонов щитовидной железы в детской и подростковой возрастных группах. Большая часть публикаций посвящена изучению влияния ПАУ на гормональную систему взрослого населения, животных и в условиях in vitro [13][23–28].

В представленном исследовании рассмотрено влияние ряда ПАУ и метилпроизводных ПАУ на функцию щитовидной железы у детей и подростков в возрасте 4–14 лет. Установлено повышение уровня гормона Т4 свободного с повышением концентрации нафталина и 2-метилнафталина в крови. В результате проведенных исследований показано, что тиреотропный гормон ТТГ положительно ассоциируется с нафталином, 2-метилнафталином, антраценом и пиреном. Повышение уровня ТТГ в сыворотке соответствует снижению продукции свободного Т4 при наличии антрацена. Нафталин и 2-метилнафталин усиливают выработку гормона Т4 свободного на фоне повышения уровня ТТГ. Увеличение количества антител к ТПО в представленных исследованиях положительно связано с концентрацией нафталина, снижение АТ к ТПО наблюдается при повышении концентраций 9-метилантрацена и пирена в образцах крови. Повышенный уровень антител к тиреопероксидазе характерен при наличии в организме аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. В проведенном исследовании уровень антител к тиреоглобулину повышается с увеличением концентрации 2-метилнафталина, антрацена, 9-метилантрацена и пирена в крови детей. Антитела к тиреоглобулину являются индикатором аутоиммунного поражения щитовидной железы. Высокий уровень в крови АТ к ТПО и АТ к ТГ может быть связан с повышенным риском развития гипотиреоза – снижения выработки тиреоидных гормонов.

Низкий или умеренный уровень корреляции (r в пределах 0,1–0,5) может свидетельствовать о наличии слабой или умеренной связи между признаками, что имеет значение при исследовании сложных явлений, например, в медико-биологических исследованиях. ПАУ, являясь ксенобиотиками, оказывают многоуровневое воздействие на организм через эндокринные, иммунные и биохимические механизмы, что затрудняет фиксирование тесной линейной зависимости. Высокие значения корреляций свидетельствовали бы о прямой связи между содержанием ПАУ и концентрацией гормонов, в то время как существует множество других факторов, которые обуславливают различный гормональный уровень при одних и тех же концентрациях, уменьшая коэффициент корреляции. Обнаруженные в представленной работе значения r от 0,13 до 0,49 согласуются с литературными данными, статистически значимы и типичны для исследований, направленных на выявление потенциальных рисков воздействия ПАУ.

Полученные зависимости согласуются с результатами исследования Kelishadi R. и соавт. по изучению влияния гидроксипроизводных полициклических ароматических углеводородов на гормоны щитовидной железы у детей [29]. Авторы отмечают значительную положительную корреляцию между уровнями метаболитов нафталина, пирена, фенантрена и гормонами Т4 свободным и ТТГ в группе школьников в возрасте 6–18 лет (R² = 0,42–0,87; р < 0,001). В наших исследованиях положительная корреляция получена между концентрациями нафталина и 2-метилнафталина в крови и Т4 свободным (R² = 0,14–0,17; р < 0,05), а также между содержанием нафталина, 2-метилнафталина, антрацена и пирена в образцах крови и уровнем ТТГ в сыворотке (R² = 0,22–0,63; р < 0,05) в группе детей в возрасте 4–14 лет.

Поиск по доступным реферативным базам данных не позволил выявить научную литературу, описывающую у детей связь ПАУ с уровнем антител к гормонам щитовидной железы (АТ к ТПО и АТ к ТГ), которые являются индикаторами аутоиммунного поражения щитовидной железы. В данном исследовании подтверждается связь повышения уровня антител к ТПО с увеличением в крови концентрации нафталина, а также повышения количества антител к ТГ с увеличением в образцах крови 2-метилнафталина, антрацена, 9-метилантрацена и пирена.

В результате проведенных исследований получены максимальные недействующие концентрации нафталина, антрацена и пирена в образцах крови детей по критерию экспрессии тиреотропного гормона. Полученные данные могут быть использованы для оценки риска воздействия полициклических ароматических углеводородов на эндокринную систему детей и подростков в условиях аэрогенного воздействия.

Заключение. Настоящее исследование проведено с целью оценки влияния ПАУ на уровень гормонов щитовидной железы и установления максимальных недействующих концентраций ПАУ в крови по критериям тиреоидного профиля детей и подростков в условиях аэрогенных экспозиций. Получены достоверные регрессионные модели индивидуального воздействия ПАУ, ассоциированного с уровнем показателей тиреоидного профиля (F = 4,77–18,7; p ≤ 0,05). Установлены максимальные недействующие концентрации полициклических ароматических углеводородов в крови детей и подростков по критерию экспрессии тиреотропного гормона. Установленные максимальные недействующие концентрации полициклических ароматических углеводородов в крови могут быть рекомендованы в качестве критериев безопасности при хроническом воздействии в рамках проведения биомониторинга, при оценке рисков здоровью детского населения.