Оценка патогенного потенциала микроорганизмов атмосферных аэрозолей

Введение. Биологическая компонента атмосферы способна влиять на климат, характер атмосферных процессов, оказывать влияние на здоровье населения [1][2]. Общая характеристика качества атмосферы Новосибирска в 2023 г. по уровню загрязнения оценена как повышенная¹, в число загрязнителей атмосферы входят аэрозоли, значительная часть которых контаминирована микроорганизмами различных таксономических групп, включая способные вызывать заболевания [3][4]. В литературе имеются многочисленные данные о микробиоме атмосферного воздуха городской среды и пригородов, сельскохозяйственных районов [5][6], но биогенный состав аэрозолей атмосферы северных территорий России, включая Новосибирский регион, остается наименее изученным.

Цель: определение концентрации и таксономической принадлежности микроорганизмов, изолированных из атмосферных аэрозолей г. Новосибирска и пригорода в весенне-летний период 2023 года, тестирование полученных микробных изолятов на наличие свойств патогенности.

Материалы и методы. Проведено изучение биоразнообразия и концентрации культивируемых микроорганизмов в атмосферных аэрозолях Новосибирского региона в течение 09.2020–09.2023 гг. при выполнении комплексных работ, посвященных характеризации аэрозолей атмосферы Новосибирска с определением их метагеномного и химического состава. Параллельно с метагеномными исследованиями микробиома воздуха, выполненными с помощью методов высокопроизводительного секвенирования [7][8], c целью определения концентрации и состава культивируемых микроорганизмов исследовано 232 образца атмосферного воздуха, отобранных фильтрацией, выделено в культуру 4197 штаммов бактерий и грибов. Образцы атмосферных аэрозолей отбирали фильтрацией атмосферного воздуха с применением армированных тефлоновых мембран Sartorius и компрессоров Hopar, позволяющих за 12 часов отобрать 21,6 м³ воздуха [9]. Координаты точек отбора образцов аэрозолей Новосибирска и области: А – Академгородок (Советский район г. Новосибирска, 54.50’40.20° × 83.07’07.02°); С – г. Новосибирск Калининский район, 55.04’24.44’’ × 82.57’08.68); N – с. Двуречье Новосибирской области (54.959118° × 83.210469°); V – р.п. Кольцово Новосибирской области, 54.935467° × 83.201531°). Для выделения микроорганизмов фильтры с сорбированными на них частицами атмосферных аэрозолей помещали в пробирки с физиологическим раствором, содержимое пробирок интенсивно перемешивали на качалке и вортексе. Полученные смывы с фильтров (рабочие суспензии) использовали для высева в жидкие и агаризованные питательные среды для выделения микроорганизмов разных физиологических групп, как описано ранее [7]. Емкости с высевами инкубировали при температуре 28–30 °С в течение 3–14 суток. Колонии выросших микроорганизмов использовали для получения чистых культур и дальнейшего их изучения.

Сравнительная количественная оценка концентрации микроорганизмов в пробе дается как КОЕ/мл суспензии аэрозоля. Морфологию клеток микроорганизмов исследовали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью микроскопа Axioskop 40 (Германия). Наличие патогенных признаков (продукция щелочной фосфатазы, наличие каталазной, гемолитической, фосфолипазной, коагулазной, желатиназной, протеазной активностей) определяли косвенным методом при высеве микроорганизмов на диагностические среды с применением специфических субстратов².

Чувствительность исследуемых культур к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом с применением дисков производства НИЦФ (Россия) с концентрацией (мкг/диск): гентамицин (10), канамицин (30), ванкомицин (30), левофлоксацин (5), бензилпенициллин (10Е), оксациллин (10), ципрофлоксацин (30) тетрациклин (30), имипенем (10), стрептомицин (30).

Таксономическую принадлежность выделенных из аэрозолей микроорганизмов определяли по суммарным данным, полученным при исследовании фенотипических признаков в соответствии с рекомендациями³. ДНК из бактериальных изолятов выделяли с помощью набора GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher). Далее, используя праймеры 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) и 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT), получали ампликон, соответствующий гену 16S рРНК⁴. В ПЦР использовали Phusion Hot Start II Polymerase (NEB) с программой: 98 °C – 1 мин. [ 98 °C –10 сек., 62 °C – 15 сек., 72 °C – 45 сек.] × 33 цикла, 72 °C – 7 мин. Определение нуклеотидных последовательностей проводилось на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3130XL (Applied Biosystems, USA) с использованием набора реагентов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) и праймеров 27F и 1492R. Прямое и обратное прочтение сшивали, получая контиг в CLC Main Workbench (Qiagen). Анализ контигов с целью определения таксономии ближайших гомологов выполняли с помощью nucleotide blast⁵ по базе Nucleotide collection (nt).

Для проведения высокопроизводительного секвенирования бактериальную культуру с отдельных колоний на твердой питательной среде отбирали с помощью стерильной одноразовой микробиологической петли и суспендировали в 200 мкл фосфатно-солевого буфера. Из суспензии отбирали образец объемом 100 мкл, переносили в лизирующий раствор из комплекта реагентов для выделения тотальной РНК/ДНК РИБО-преп (Россия), прогревали при 65 °C в течение 20 минут в твердотельном термостате и далее проводили экстракцию нуклеиновых кислот согласно инструкции производителя. Растворение осадка нуклеиновых кислот проводили в 40 мкл деионизованной воды с прогреванием при 65 °C в течение 5 минут и резким охлаждением на льду. Концентрацию полученной геномной ДНК измеряли с помощью Qubit 3.0 с использованием набора Qubit dsDNA HS Assay Kit. Секвенирование полногеномных последовательностей проводили на приборе NextSeq 550 (США). Подготовку ДНК-библиотек осуществляли при помощи наборов реагентов NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina и NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Великобритания) согласно инструкции фирмы-производителя. В полученных в результате секвенирования файлах в формате FastQ удаляли адаптеры, короткие и низкокачественные последовательности (качеством менее 20 и длиной менее 30 нуклеотидов). Предобработанные прочтения собирали в контиги с использованием программы SPAdes v3.13.1 с параметром carefu1⁶. Таксономический анализ полученных контигов проводили при помощи BLASTn v2.9.0 +, используя базу данных Genbank⁷.

Расчет числа культивируемых микроорганизмов в пробах проведен по методу Кербера, при этом количество микроорганизмов усреднялось по 3 параллелям высеянных проб. Суммарные величины численности культивируемых микроорганизмов рассчитывались как средние по повторностям ± доверительный интервал на уровне значимости 95 % (< 0,05)⁸.

Для дальнейшего изучения признаков и оценки патогенного и функционального потенциала создана коллекционная база микробных аэроизолятов (6197 ед. хранения), отражающих биоразнообразие микробиоты атмосферы Новосибирского региона, хранящихся при низкотемпературном замораживании в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН «ГНЦ ВБ “Вектор”» Роспотребнадзора.

Результаты. Концентрация культивируемых микроорганизмов в отдельных образцах аэрозолей значительно колебалась, составляла от единиц до (8–9) × 10³ КОЕ/м³, что свидетельствует о значительных ее контрастных изменениях, происходящих в атмосфере. Отмечено сезонное колебание численности с ее снижением в зимние периоды, доходящей до нулевого значения в дни обильных снегопадов, аналогичную ситуацию наблюдали в теплый период после ливней или затяжных дождей. Соотношение отдельных таксономических групп в исследуемых образцах аэрозолей было изменчивым, определенных закономерностей не выявилось. Отмечены единичные резкие увеличения численности как в городе, так и в пригородах представителей ряда таксонов, таких как Acinetobacter, Bacillus, Staphylococcus, Micrococcus, а также грибов под влиянием местных или привнесенных источников.

На рисунке представлены сезонные изменения концентрации микроорганизмов в 2023 г., показанные для четырех точек отбора в течение дневного и ночного времени. Дневные концентрации несколько выше ночных, те и другие для всех точек отбора наиболее выражены с июля по сентябрь. Осенью высокая численность микроорганизмов во многих образцах аэрозолей обеспечена преобладанием в пробах плесневых грибов. Наименьшие концентрации культивируемых микроорганизмов выявлены в образцах, отобранных в с. Двуречье (точка отбора N).

Наиболее высокие пики численности культивируемых микроорганизмов ((8–9) × 10³ КОЕ/м³) обнаружены во время летнего периода 2023 г. в пробах Новосибирска и р. п. Кольцово (точки отбора С и V соответственно), представленных грибами, спорообразующими и неспороносными бактериями, многие из которых способны к образованию защитных пигментов каратиноидного или меланинового ряда. Проведена идентификация бактерий и грибов, выделенных из атмосферных аэрозолей в период с мая по август 2023 г.

Разнообразие грибов представлено микромицетами с преобладанием родов Aspergillus, Alternaria, Cladosporium, Aureobasidium и Penicillium.

Наибольшую их суммарную концентрацию наблюдали в весенне-летних и ранне-осенних пробах, достигавшую от 150 до 6,7 × 10³ КОЕ/м³ в отдельных образцах аэрозолей, с последующим снижением в аэрозолях позднеосеннего периода. Минимальная численность грибов наблюдается в зимний период.

По фенотипическим признакам и результатам анализа последовательностей гена 16S рРНК (97,5–100 % сходства с данными GenBank) идентифицированы 119 изолятов, отнесенных к спорообразующими бактериями родов Bacillus, Paenibacillus, Priestia, Lysinibacillus, Peribacillus, Metabacillus, Solibacillus и др.; неспороносным бактериям родов Nocardiopsis, Planomicrobium, Pseudomonas, Artrobacter, Brevundimonas, Curtobacterium, Psychrobacter, Stutzerimonas, а также родов Kocuria, Planococcus, Mammaliicoccus, Macrococcus, Staphylococcus, Sporosarcina и ряду других.

С целью уточнения идентификации проведено полногеномное исследование для 49 выделенных штаммов (наименования видов приведены в таблице), а также их тестирование на признаки патогенности по наличию секреции таких ферментов, как каталаза, гемолизины, лецитиназа, липазы, плазмокоагулаза, щелочная фосфатаза, желатиназа, по способности к капсулообразованию. Исследована также их чувствительность к антибиотикам.

Выяснено, что продукцией каталазы и щелочной фосфатазы разной активности обладают все штаммы исследуемой группы, наиболее выраженной – штаммы бацилл Bacillus safensis Kh-359, B. cereus Kh-363 и Ка-171, B. altitudins Ka-121, B. pumilis Ka-146, B. velezensis Ka-169, Priestia megaterium Kh-378, а также – неспороносные бактерии Kocuria rosea Kh-387 и Kh-436. Штаммы стафилококков S. pseudoxylosus Kh-407 и S. saprophyticus Kh-408 показали высокую продукцию не только каталазы, но и щелочной фосфатазы (47,7 и 56,7 е. а. соответственно). Высокую активность этого фермента (50,4–65,7 е. а.) проявили также штаммы B. mycoides Ka-120, Pantoea agglomerans Ka-175, Lysinibacillus sphaericus Ka-167 и Ka-168.

Желатиназная активность присутствовала у 28 из исследуемых 49 штаммов, 36 штаммов секретировали протеазы, развитые капсулы образовывали 23 штамма. Фосфолипазная и липазная активности показаны для 10 и 11 культур соответственно. При высеве бактерий на кровяной агар α-гемолиз разной интенсивности обнаружен для 14 штаммов. Положительный ответ на реакцию плазмокоагуляции дали 13 штаммов.

Выявлены 29 штаммов, имеющих 5–7 положительных реакций из 9 при тестировании на патогенность в условиях опыта. К ним относятся такие штаммы, как Bacillus safensis Kh-359, Bacillus cereus Ка-171 и Kh-363, Priestia megaterium Kh-378, Kh-395 и Kh-396, Bacillus mycoides Kh-412 и Ка-120, а также штаммы Pantoea agglomerans Ка-175, Staphylococcus equorum Kh-405 и Kh-434, Acinetobacter lwoffii Kh-457 и ряд других. Следует отметить, что вышеупомянутые виды бактерий способны вызвать инфекционные заболевания, а перечисленные бациллы имеют отношение к группе цереус.

Определение чувствительности к антибиотическим препаратам микроорганизмов, обладающих признаками патогенности, необходимо для определения возможности контролировать их рост и подавление вызываемого ими инфекционного процесса. Наименее эффективными относительно штаммов аэроизолятов оказались оксациллин и бензилпенициллин (табл. 1), к остальным антибиотикам большая часть исследуемых штаммов показала высокую чувствительность. Тем не менее 11 штаммов, проявивших устойчивость к 4–7 препаратам, можно отнести к полирезистентным. Это штаммы Bacillus cereus Kh-363 и Kh-171, Priestia megaterium Kh-371, Staphylococcus pseudoxylosus Kh-407, Staphylococcus saprophyticus Kh-408, Macrococcus caseolyticus Kh-431, Acinetobacter lwoffii Kh-457, Kh-457-1 и ряд других (табл. 1).

Обсуждение. Сапротрофные микроорганизмы окружающей среды, а также условно-патогенные микроорганизмы микробиоты человека потенциально могут вызвать заболевания разной степени тяжести. У изолятов, образующих эндоспоры, выделенных из атмосферы Новосибирска и области, преобладали бактерии рода Bacillus. Среди них обнаружены сапротрофные бациллы и способные вызывать инфекционные процессы. Так, изолят Kh352 отнесен к виду Bacillus toyonensis, известному широким спектром антимикробной активности [10], но и способностью вызвать острую инфекцию со смертностью [11]. Представители группы цереус, такие как B. cereus, B. mycoides, B. megaterium, B. thuringiensis, B. toyonensis, экспрессируют широкий спектр белковых токсинов, способны проявлять патогенные свойства, быть причиной различных заболеваний⁹ [12][13]. К этой группе отнесены бактериальные изоляты Kh-352, Kh-363, Kh-171, Kh-385, Ka-120, Ka-151, Kh-471, Kh-492. Бактерии видов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, известные как сапротрофы, могут вызвать острые пищевые инфекции (49 эпизодов с более чем 175 случаями в Австралии, Новой Зеландии и Канаде). Почвенные бактерии Lysinibacillus sphaericus (у нас это штаммы Ka-167, Ка-168) явились причиной урогенитальной инфекции; описан случай тяжелого сепсиса, вызванного Lysinibacillus и Paenibacillus (Kh-422, Kh-423, Kh-503¹⁰)¹¹.

Выделены также неспороносные бактерии, относящиеся к виду Kocuria rosea (Kh-372, Kh-387, Kh-392, Kh-409, Kh-436, Kh-459, Kh-460), способные вызвать инфекции мочеполовых путей, холецистит, мастит, кератиты, прежде всего у людей с ослабленным иммунитетом [14][15], бактерии вида Kocuria rhizophila (Ka-122), известные как возбудители инфекций у рыб [16]. Обнаружена бактерия Pantoea agglomerans (Ka-175), чаще всего ответственная за болезни растений, но способная вызвать инфекции систем органов у людей [17].

Особое внимание привлекают бактериальные изоляты, идентифицированные как относящиеся к родам Acinetobacter (Kh-454, Kh-455, Kh-457, Kh457-1) и Staphylococcus (Kh-373, Kh-405, Kh-407, Kh-408, Kh-411, Kh-434, Kh-437). Ацинетобактеры являются наиболее частыми возбудителями тяжелых инфекций, наряду с MRSA, синегнойной палочкой входят в число наиболее опасных внутрибольничных патогенов с множественной антимикробной резистентностью. Бактерии вида Acinetobacter lwoffii, к которому отнесены изоляты Kh-455, Kh-457, Kh-457-1, являются возбудителями пневмонии, сепсиса, уроинфекций, гастрита, инфекций мягких тканей [18].

Штаммы стафилококков способны продуцировать энтеротоксины, что приводит к необходимости контролировать контаминацию бактериями этого рода, включая Staphylococcus equorum (Kh-405, Kh-434), обычно выделяемый из клинического материала¹²; Staphylococcus saprophyticus (Kh-408), так как бактерии этого вида являются распространенными возбудителями мочеполовых путей, продуцируют гемолизины¹³. Вид Staphylococcus pseudoxylosus (Kh-407, Kh-437), выделенный из мастита крупного рогатого скота, генетически тесно связан с коагулазоотрицательными видами стафилококков S. xylosus, S. saprophyticus [19]. Бактерии вида Staphylococcus borealis (Kh-373) отнесены к новому виду, первоначально были определены как Staphylococcus haemolyticus, выделены из кожи и крови человека [20]. Представители вида Staphylococcus pasteuri (Kh-411) все чаще становится возбудителем нозокомиальных инфекций и контаминантом производных крови, проявляют устойчивость к нескольким классам антибиотиков¹⁴. Таким образом, литературные [10–20] и клинические данные свидетельствуют о расширении списка микроорганизмов, способных вызвать инфекционные заболевания разной степени тяжести.

Среди исследуемых микроорганизмов обнаружены виды, применяемые в качестве продуцентов различных соединений, включая антибиотики (Peribacillus butanolivorans Kh-353, Bacillus thuringiensis Kh-385, Bacillus altitudinis Kh-465, Bacillus amyloliquefaciens Kh-489, Bacillus velezensis Kh-493 и др.) [21–24], соединения, обладающие противоопухолевой активностью (Solibacillus silvestris Kh-399)¹⁵, способностью к деструкции нефти (Bacillus safensis Kh-359) [25], проявляющие другие полезные свойства, используемые для производства препаратов различного назначения, что позволяет рассматривать выделенные из аэрозолей штаммы этих видов как ресурс для биотехнологических исследований.

Заключение. Исследована микробиота атмосферных аэрозолей г. Новосибирска и пригорода в весенне-летний период 2023 года, характеризующийся наиболее высокой загрязненностью взвешенными частицами. Изолировано большое разнообразие культивируемых микроорганизмов, представленных сапротрофными и патогенными бактериями и грибами. Полученные данные имеют значение для оценки функционального и патогенного потенциала микробиома атмосферных аэрозолей Новосибирского региона, его опасности для здоровья населения, являются важным дополнением в характеристику биогенной компоненты атмосферы городской среды.

Исследование проведено при частичном финансировании проекта РФФИ № 19-05-50032 и Государственного задания Роспотребнадзора № 11/21, а также при поддержке федерального проекта «Санитарный щит страны – безопасность для здоровья (предупреждение, выявление, реагирование)» в рамках проекта «Создание национального интерактивного каталога патогенных микроорганизмов и биотоксинов».