Гигиенические и морфологические аспекты применения водного раствора молекулярного водорода в экспериментальной модели поллиноза

Введение. Пандемия аллергических заболеваний считается расплатой человечества за стремительный цивилизационный прогресс [1]. Множественные факторы урбанизации лимитируют адаптационные возможности организма человека, делая его подверженным воздействию аллергических агентов. Аллергический ринит от пыльцы растений занимает лидирующее место в структуре аллергопатологии. Заболевание вносит изменения в повседневную рабочую, учебную, бытовую деятельность [2–4]. Прямые и косвенные затраты здравоохранения на лечение аллергического ринита характеризуются ростом год от года [5–7].

Барьерные ткани организма содержат мощный пул клеток, защищающих организм от воздействия различных пыльцевых и химических агентов (ХА), одни из которых – тучные клетки (ТК) [8–9]. Аккумулируя огромное количество химических агентов, окружающая среда через различные объекты жизнедеятельности человека способствует поступлению их в организм.

На территории Воронежской области заболеваемость поллинозами выше среди детского и подросткового населения. К территориям с высоким риском заболеваемости отнесены 8 районов [10].

Воздействие аллергенных компонентов вызывает активацию многочисленных воспалительных элементов и влечет за собой дисфункцию эпителиальных клеток, вследствие чего выделяются активные формы кислорода (АФК), эффекты которых усугубляются от воздействия ХА [11–12].

В качестве маркера оценки воздействия поллютантов на слизистую носа животных в эксперименте нами были выбраны тучные клетки (ТК).ТК обнаруживаются практически во всех органах человека, особенно велико их количество в местах, контактирующих с окружающей средой [13]. ТК являются дирижерами состояния специфического тканевого микроокружения [14]. Во время дегрануляции ТК происходит высвобождение медиаторов, которые несомненно играют важную роль в патогенезе развития реакции гиперчувствительности [15]. Поиск новых эффективных методов влияния на функциональную активность ТК как с терапевтическим, так и профилактическим эффектами представляют особый интерес. В частности, известные биологические эффекты молекулярного водорода (Н₂) позволяют рассматривать водород в качестве эффективного молекулярного агента [16–17].

Цель исследования: морфологическая оценка количественного состава ТК при изолированном и комбинированном воздействии пыльцевых и химических агентов, а также морфологическое обоснование применения водного раствора, обогащенного молекулярным водородом для вторичной профилактики поллиноза.

Материалы и методы. Экспериментальное моделирование поллиноза с последующим воздействием ХА и водного раствора (ВР) Н₂ проводилось на базе НИИ экспериментальной биологии и медицины ФГБОУ ВО «ВГМУ им. Н.Н. Бурденко» Минздрава России. В эксперименте продолжительностью 55 дней приняли участие 204 половозрелых самца крыс (34 группы, n = 6) линии Wistar массой (200 ± 10) грамм. Период исследования с 18.05.2022 по 11.07.2022. После поступления животных из питомника в НИИ ЭБМ в течение 7 дней происходила их адаптация к условиям содержания.

Экстракты аллергенов (ЭА) березы повислой и амброзии поллынолистной были выбраны, как наиболее распространенные пыльцевые аллергены Воронежской области [18–19]. Применялись медицинские иммунобиологические препараты производства АО «НПО «Микроген», Россия, концентрация 10 000 PNU.

В эксперименте применялось изолированное, а также комбинированное воздействие пыльцевых и ХА. Согласно проведенным экспериментальным исследованиям, моделирование аллергического ринита осуществлялось в два этапа [20–24]. Проведена базовая и интраназальная стимуляция растворами ЭА.

Введение растворов ЭА пыльцы представлено в таблице.

В качестве ХА были использованы нитрат и нитрит натрия производства ООО «Предприятие “РОД”» и АО «База № 1 химреактивов», Россия. Нитратное загрязнение питьевой воды и пищевых продуктов на территории Воронежской области, по данным социально-гигиенического мониторинга, является актуальной проблемой [25–26]. ХА были разведены в физиологическом растворе NaCl до 2 мл для внутрижелудочного введения. Расчет дозы ХА, вводимой экспериментальным животным, определялся на основании публикаций с аналогичными исследованиями [27–29]. По итогам предварительного химического воздействия была определена необходимая экспериментальная доза, приводящая к регистрации метгемоглобина в крови, – 34 ± 1,65 мг NaNO3 и 1,2 ± 0,12 мг NaNO₂. За действующим веществом следовал период воздействия ВР Н₂, который готовили c использованием картриджа aquela 8.0 (производитель Aquelablue). Введение ВР Н₂ осуществлялось в группах животных № 2, 5 интраназально, в группах № 8, 11, 33 внутрижелудочно, в группах № 14, 17, 20, 23, 26, 29 интраназально и внутрижелудочно (таблица). Для доказательства положительного профилактического эффекта ВР Н₂, в эксперименте были выделены группы, в которых после основных блоков введения пыльцевых и химических агентов следовал период без воздействия. В экспериментальных группах, где производилось ВР Н₂, и в группах с периодом без воздействия после периода интраназальной стимуляции ЭА проводилась поддерживающая сенсибилизация. В группе контроля (ГК) № 31 осуществлялось интраназальное воздействие физиологического раствора (таблица).

После завершения экспериментального воздействия на следующие сутки животные подвергались передозировке ингаляционным наркозом (Изофлуран). Вывод был осуществлен на 15-й день эксперимента в группах № 7, 10, 32, на 28-й день в группах № 1, 4, на 29-й день в группах № 8, 9, 11, 12, 33, 34, на 42-й день в группах № 2, 3, 5, 6, 13, 16, 19, 22, 25, на 55-й день в группах № 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29–31. Для морфологического исследования производился забор участка слизистой оболочки. Подготовленные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, идентификация ТК осуществлялась окрашиванием раствором Гимза. Оценивали общее количество ТК, дегрануляцию, межклеточное взаимодействие и наличие свободнолежащих гранул.

Для функциональной характеристики ТК был использован запатентованный способ окрашивания триптаза-позитивных тучных клеток с докрашиванием раствором Май – Грюнвальда¹. Морфометрический анализ проводился на микроскопе ZEISS AxioImager. A2. Использовалась программа Statistica 12.0. Для оценки достоверности различий использован параметрический критерий Стьюдента для независимых числовых выборок.

Результаты. Выявлено, что в процессе базовой стимуляции в течение первых 14 дней у животных экспериментальных групп симптомы не наблюдались. После начала интраназального введения ЭА пыльцы у животных всех групп отмечались симптомы аллергического ринита до 30–37 дня эксперимента.

ТК слизистой оболочки ГК характерно располагались периваскулярно и вокруг клеток жировой ткани, преимущественно либо без признаков дегрануляции, либо слабой выраженности. При воздействии ЭА и ХА происходила активная миграция ТК в локусы воздействия и увеличение численности клеточной популяции с признаками их активации и высвобождения медиаторов (рис. 2). Оценка микропрепаратов, окрашенных раствором Гимза, показала достоверное увеличение количества ТК с метахромазией до 3 раз во всех исследуемых группах по отношению к ГК (p < 0,05) (рис. 1).

В группе воздействия ХА количество ТК также достоверно превышало значения ГК (p < 0,05) (рис. 1), однако выявить характерные особенности при данном окрашивании не удалось.

В связи с этим особый интерес представляла комбинированная оценка секретома, позволившую визуализировать метахроматично окрашенные и триптаза-позитивные ТК в одном микропрепарате (рис. 3). Наполненность метахроматичных ТК риптаза-позитивными гранулами на 1/3 и 2/3 отмечена при воздействии ЭА пыльцы березы и амброзии, по сравнению с ГК (рис. 3). Отмечалась активизация секреции и высвобождения триптазы ТК с заполнением гранул триптазой на 1/3, 2/3 и 3/3 цитоплазмы в группе с комбинированным воздействием, особенно, в группах с комбинацией введения ЭА амброзии и ХА (↑протеазы в 2,9 раза) (рис. 2, 3).

Воздействие ВР Н₂, приводило к снижению степени дегрануляции ТК, снижению активации ТК и уменьшению их количества на 5–30 % в группах с различными комбинациями ЭА и ХА (p < 0,05) (рис. 1).

Обсуждение. Изолированное воздействие пыльцевых ЭА в эксперименте приводило к развитию признаков аллергического процесса с классическими клиническими симптомами.

В настоящее время имеются многочисленные экспериментальные данные, демонстрирующие важную роль АФК в регуляции дегрануляции ТК на in vitro и in vivo моделях. АФК могут стимулировать выработку многих провоспалительных медиаторов ТК, например триптазы [24]. Использование H₂ в качестве вещества с антиоксидантными свойствами обеспечивает снижение активности дегрануляции ТК и, как следствие, снижение АФК. Данные эффекты Н₂ проявлялись во всех группах воздействия как с одинарным интраназальным или внутрижелудочным введением, так и при комбинации двух методов введения ВР H₂. ТК тесно вовлечены в развитие биологических эффектов Н₂ и могут оказывать влияние на развитие его противоаллергических, противовоспалительных, антиапоптотических, иммуномодулирующих, вазотропных эффектов и эффектов ремоделирования внеклеточного матрикса [24].

Заключение. Отмечен возможный профилактический эффект ВР Н₂, на течение аллергического процесса, отягощенного введением ХА, вне зависимости от способа его введения. Применение ВР Н₂, способствовало достоверному (p < 0,05) уменьшению численности метахроматичных и триптаза-позитивных ТК, снижению их дегрануляции, что может свидетельствовать о стабилизирующем влиянии Н₂ на процесс активации ТК. Интраназальное введение ВР Н₂ было достаточным для локального развития эффекта снижения реактивности тканей на воздействие ЭА.