Оценка острой токсичности наночастиц оксида свинца на крысах при ингаляционной экспозиции

Введение. Свинец, будучи известным загрязнителем среды обитания на протяжении тысячелетий, продолжает и сегодня оставаться угрозой для здоровья человека.

В результате производственной деятельности человека образуются аэрозоли сложного состава, включающие ультратонкую фракцию. Их источниками являются многие производственные процессы, например сварочные работы, различные этапы обработки металлов на металлургических предприятиях. Ультратонкие частицы наноразмерного диапазона (наночастицы – НЧ) составляют значительную долю загрязняющих аэрозолей, что обуславливает высокую вероятность их попадания в организм через дыхательные пути [1]. Кроме того, существует вероятность неблагоприятного воздействия на организм человека наночастиц природного происхождения, образующихся в результате лесных пожаров, вулканических выбросов.

Широко изучено токсическое действие свинца и его наноразмерных соединений на нервную [2], кроветворную [3] и репродуктивную системы [4], на состояние почек [5], но данные об особенностях острого ингаляционного воздействия его наночастиц по-прежнему ограничены.

В исследовании Lebedova и соавт. (2018) установлено, что острое 4-часовое ингаляционное воздействие на мышей НЧ PbO в концентрации 40,6 мг/м3 вызывает накопление НЧ в легких: альвеолярных эпителиальных клетках типа I, макрофагах и нейтрофилах. Увеличивалось количество макрофагов в альвеолярных пространствах легких, уровень глутатион-S-трансферазы повысился. Уровень окисленного глутатиона снизился в легких через 12 ч после воздействия [6].

Bláhová и соавт. (2020) в исследованиях на мышах выявили, что при воздействии наночастиц оксида свинца (НЧ PbO) (192,5 мкг/м3; 1,93 × 106 частиц/см3) в течение 2 недель путем непрерывной ингаляции происходит перераспределение Pb из легких в почки и печень. Гистопатологические изменения, наблюдаемые в основном в легких и печени, указывали на воспалительные реакции и проявления токсичности [7].

В условиях экспериментального исследования на белых мышах линии ICR, непрерывно подвергавшихся воздействию аэрозоля НЧ PbO в ингаляционной установке типа «все тело» в течение 6 недель со средней концентрацией 121,7 мкг/м3, Dumková и соавт. (2018) заключили, что вдыхание наночастиц оксида свинца оказывает множественное негативное воздействие на легкие мыши как основной орган-мишень. В альвеолах было обнаружено повышенное количество нейтрофилов и макрофагов.

В бронхиолах наблюдалось повышенное выделение слизи, десквамированные эпителиальные клетки, нейтрофилы и единичные эритроциты. Вдыхание наночастиц PbO также вызвало обширную периваскулярную и перибронхиолярную инфильтрацию лимфоцитов, характерную для субхронического воспаления [8].

Ранее нашим коллективом проводилось изучение ингаляционного воздействия аэрозоля наночастиц оксида свинца в концентрации 1,30 ± 0,10 мг/м3 в течение 5 дней по 4 часа в день в установке «только нос». Наблюдался типичный приток нейтрофильных лейкоцитов и альвеолярных макрофагов на поступление наночастиц в легкие. Показана задержка наночастиц в легких и обонятельных луковицах крыс. Помимо этого, в опытной группе выявлены нарушения, характерные для воздействия свинца (увеличение доли ретикулоцитов, выделение с мочой δ-аминолевулиновой кислоты и развитие артериальной гипертензии) [9].

Несмотря на то что дыхательная система является одним из основных путей проникновения НЧ PbO в организм человека, данные о его потенциальном остром ингаляционном воздействии в мировой научной литературе ограничены. Таким образом, цель исследования – изучение острой токсичности наночастиц оксида свинца при ингаляционном поступлении в условиях эксперимента на крысах.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые исследуется влияние наночастиц оксида свинца в концентрации 0,215 мг/м3 на лабораторных животных в условиях однократного воздействия. Ранее ряд авторов показали оценку экспозиции к НЧ PbO в сходной концентрации 192,5 мкг/м3 в подостром эксперименте [7], а в концентрации 121,7 мкг/м3 – субхроническом [8].

Материалы и методы. Наночастицы свинца генерировались с помощью электрического искрения из 99,99 % чистого свинцового стержня диаметром 5,6 мм в атмосфере азота. Поток полученных НЧ Pb, смешиваясь с воздухом (6 л/мин) для охлаждения, окислялся в наночастицы оксида свинца II (НЧ PbO), которые подавались в экспозиционную башню для воздействия «только нос» (CH Technologies, Westwood, NJ, USA) с крысами, помещенными в индивидуальные сдерживающие устройства (рестрейнеры). Для мнимого воздействия на контрольных крыс использовалась установка такой же конструкции, полученная от того же производителя.

Характеристики НЧ PbO представлены на рисунке. Химическая идентичность НЧ, отобранных на поликарбонатные фильтры, была определена как PbO с помощью Рамановской спектроскопии.

Эксперимент проводился на аутбредных крысах-самках исходной массой 247,9 ± 10,5 г. Животные были разделены на две группы по 10 животных в каждой. Первая группа была контрольной и дышала чистым нефильтрованным воздухом, вторая группа подвергалась воздействию НЧ PbO размером 18,2 ± 4,2 нм в концентрации 0,215 мг/ м3 в течение 4 часов. Выбор концентрацией обусловлен задачей исследования – впервые изучить реакцию глубоких дыхательных путей у крыс в ответ на острое воздействие НЧ PbO. Эксперимент проводится в рамках работы, направленной на определение потенциально безопасных уровней воздействия наночастиц оксида свинца в рамках отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора на 2021–2025 гг. «Научное обоснование национальной системы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия, управления рисками здоровью и повышения качества жизни населения России».

Животных содержали в обособленном помещении вивария Центра, они дышали нефильтрованным воздухом, снабжались бутилированной артезианской водой и стандартным сбалансированным кормом. Эксперимент планировался и проводился в соответствии с документами¹.

На следующий день, через 24 часа по завершении ингаляционного воздействия, у крыс производили взятие бронхоальвеолярной жидкости (БАЛЖ) для анализа цитологических и биохимических показателей. Животным под эфирным рауш-наркозом выполнялся забор промывных вод из легких. В промывных водах с помощью меланжера отбирали пробу жидкости с клетками. Клетки подкрашивали метиленовым синим в 3 % уксусной кислоте. Методом световой микроскопии в камере Горяева подсчитывали общее число клеток в аликвотной пробе с последующим пересчетом на весь объем БАЛЖ. Далее БАЛЖ центрифугировали 4 мин. при 1000 об/мин (200 g). Надосадочную жидкость (НОЖ) отбирали для выполнения биохимического анализа по показателям: щелочная фосфатаза (ЩФ), амилаза, аспартат- и аланинтрансферазы (АСТ, АЛТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТП). Клеточный осадок аккуратно ресуспендировали в небольшом количестве надосадочной жидкости и готовили наливные мазки. Их сушили на воздухе, фиксировали в метаноле, окрашивали азур-эозином. При световой микроскопии подсчитывали не менее 100 клеток на каждом мазке, идентифицируя альвеолярные макрофаги, нейтрофильные лейкоциты и эозинофилы.

Для определения содержания гемоглобина (HGB), гематокрита (HCT), тромбокрита (PCT), среднего объема эритроцитов (MCV), подсчета эритроцитов (RBC), лейкоцитов (WBC) и тромбоцитов (PLT) использовали автогематологический анализатор MYTHIC-18 (C2 Diagnostic, Montperllier, Франция), кровь собирали из хвостовой вены на следующий день после ингаляционного воздействия до взятия БАЛЖ. Процент ретикулоцитов подсчитывали на мазках на 1000 клеток с помощью светового микроскопа Carl Zeiss Primo Star после суправитального окрашивания бриллиантовым крезиловым синим.

Статистическую значимость различий между среднеарифметическими значениями показателей в группах оценивали с помощью t-теста Стьюдента. Значимыми считали различия при уровне значимости р < 0,05. Данные в статье представлены в виде: среднее ± стандартная ошибка.

Результаты. При цитологическом анализе БАЛЖ статистически значимые сдвиги в сравнении с контролем были отмечены по 60% из изученных показателей (табл. 1). В частности, отмечалось увеличение содержания нейтрофильных лейкоцитов (НЛ) (в 2,6 раза, p < 0,05) и снижение числа альвеолярных макрофагов (АМ) (в 1,1 раза, p < 0,05). Главный показатель цитотоксического действия – отношение нейтрофилов к альвеолярным макрофагам – также увеличился по сравнению с контролем (в 2,9 раза, p < 0,05).

Несмотря на наличие выраженной клеточной реакции глубоких дыхательных путей, значимого изменения уровня некоторых ферментов в надосадочной жидкости бронхоальвеолярного лаважа не замечено (табл. 2). Наблюдаются тенденции к росту щелочной фосфатазы, аланин- и аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтранспептидазы и лактатдегидрогеназы.

Из числа оцененных показателей крови крыс статистически значимые неблагоприятные сдвиги в сравнении с контролем были отмечены по 23 % из представленных показателей (табл. 3). К их числу относятся: увеличение абсолютного числа и относительного числа клеток крови среднего размера (в 1,9 и 1,6 раза соответственно, p < 0,05), рост абсолютного числа и относительного содержания гранулоцитов (в 1,8 и 1,6 раза соответственно, p < 0,05), увеличение ретикулоцитов (в 1,25 раза, p < 0,05).

Обсуждение. Попадание НЧ PbO в глубокие дыхательные пути вызывало увеличение фагоцитарной активности (рост числа НЛ и АМ в бронхоальвеолярной лаважной жидкости, изменение их соотношения), отраженное в табл. 1. АМ первыми начинают фагоцитировать чужеродные частицы, и продукты их разрушения привлекают НЛ. Чем более цитотоксичными оказываются чужеродные частицы – то есть, чем больше повреждений происходит под их влиянием в легочной ткани либо в популяции фагоцитирующих клеток, тем больший приток НЛ наблюдается [10].

Несмотря на полученное по результатам цитологической оценки цитотоксическое действие, поступление НЧ PbO не приводило к изменению биохимических параметров надосадочной жидкости БАЛ. ГГТП – мембраносвязанный фермент, который участвует в переносе глутамильной части глутатиона к другим аминокислотам и дипептидам [11], остался в пределах контрольных значений. Не изменился уровень внутриклеточного гликолитического фермента ЛДГ, который используется для анализа целостности клеточной мембраны [12]. Наблюдалась незначительная тенденция к росту АСТ и АЛТ в надосадочной жидкости [13], указывающая на возможное повреждение клеток легочной ткани (табл. 2).

Такие изменения согласуются с результатами ранее проведенных исследований in vivo и принятой последовательностью реакции глубоких дыхательных путей на введение чужеродных частиц [14]. Так, при однократном интратрахеальном введении крысам-самкам НЧ PbO в дозе 0,2 и 0,5 мг на крысу наблюдали токсическое действие, которое также не сопровождалось выраженным изменением биохимического состава БАЛЖ [15]. Применение более высоких доз и ингаляционной 5-кратной экспозиции в концентрации 1,30 ± 0,10 мг/ м3 уже вызывало изменение как цитологических, так и биохимических параметров [16]. Отметим, что данных о величине LOAEL либо NOAEL для НЧ PbO при воздействии на лабораторных животных нами обнаружено не было, а в исследованиях in vitro величина потенциально недействующей дозы существенно разнится в зависимости от выбранной модели исследования. Miri и соавт. в исследованиях in vitro на клеточной линии нейробластомы Neuro2A в МТТ-тесте продемонстрировали токсическое действие НЧ PbO даже в концентрациях ниже 30 мкг/мл [17], но при этом сами авторы назвали его «незначительным». Вместе с тем в исследовании Nazaripour и соавт. на клеточной линии рака толстой кишки HT-29 в МТТ-тесте показано, что НЧ PbO в концентрациях ниже 500 мкг/ мл не оказывают вредного действия [18]. В то же время Khalil и соавт. определили концентрацию полумаксимального ингибирования (IC50) НЧ PbO по отношению к свежевыделенным макрофагам человека, которая составила 57,1 мкг/мл [19].

Свинец известен своим гематотоксическим действием. Изменение концентрации гемоглобина при свинцовой интоксикации связанно с его способностью ингибировать синтез гема, что приводит к повышенному разрушению зрелых и уменьшению количества новых эритроцитов, количество которых в крови уменьшается вместе с общей концентрацией гемоглобина [20]. Вопреки ожиданиям, ни в цельной крови, ни в эритроцитах содержание гемоглобина не снизилось (табл. 3). Вероятно, для видимых изменений этих показателей должно пройти больше времени, чем в нашем исследовании.

Одним из механизмов интоксикации соединениями свинца является развитие окислительного стресса [21]. Свинец, связываясь с белками плазмы крови и тканей, способен инициировать процессы их перекисного окисления, что приводит к накоплению продуктов перекисного окисления и служит пусковым механизмом модификации клеточных мембран в сторону неконтролируемого изменения их проницаемости. Состояние эритроцитов является интегральным показателем мембран организма, их количество статистически значимо не изменилось (табл. 3). Вместе с тем относительная ширина распределения эритроцитов по объему имела тенденцию к увеличению. Известно, что увеличение показателя ширины распределения эритроцитов может косвенно указывать на укорочение жизненного цикла и ускоренную гибель этих клеток через изменение свойств мембранных липидов и белков [22].

Наряду с этим было отмечено компенсаторное усиление эритропоэза, которое проявилось в виде значительного увеличения доли ретикулоцитов, еще одного из наиболее чувствительных эффектов свинцовой интоксикации [16].

По некоторым показателям белой крови выявлено заметное, хотя и статистически незначимое увеличение: общее число лейкоцитов (в 1,41 раза, p < 0,05), число лимфоцитов и относительное их содержание (в 1,11 и 0,98 раза соответственно, p < 0,05) (табл. 3). Эти сдвиги заслуживают внимания еще и потому, что они достаточно типичны для экспериментальных свинцовых интоксикаций: так, Farkhondeh и соавт. продемонстрировали аналогичные изменения, заключающиеся в значительном увеличении общего и относительного количества лейкоцитов в экспериментальных группах [23].

Тенденция к увеличению лейкоцитов и лимфоцитов является признаком активизации клеточного иммунитета в крови в ответ на однократное ингаляционное воздействие наночастиц и повреждение, вызванное ими, как и увеличение количества гранулоцитов и их объема. Возросло число клеток среднего размера, что может указывать на разрушение наиболее крупных, а значит, зрелых клеток крови после однократного ингаляционного воздействия наночастиц оксида свинца.

Заключение. При однократном ингаляционном поступлении аэрозоля наночастиц оксида свинца размером 18,2 ± 4,2 нм в концентрации 0,215 мг/м3 в течение 4 часов показано его общетоксическое и цитотоксическое действие на крыс. Оно проявилось в изменении гематологических показателей и клеточной реакции глубоких отделов дыхательных путей.

В крови отмечено компенсаторное усиление эритропоэза, которое проявилось в виде значительного увеличения доли ретикулоцитов, а также увеличение абсолютного и относительного числа клеток крови среднего размера и гранулоцитов, что, в свою очередь, свидетельствует о развитии лейкоцитарной реакции в ответ на изменения, индуцированные поступлением наночастиц в организм.

В жидкости бронхоальвеолярного лаважа наблюдалась выраженная клеточная реакция глубоких дыхательных путей, сопровождающаяся увеличением как числа нейтрофильных лейкоцитов, так и соотношения числа нейтрофильных лейкоцитов к альвеолярным макрофагам, что является показателем цитотоксического действия наночастиц оксида свинца.

Результаты проведенного исследования позволяют утверждать, что даже однократное воздействие наночастиц оксида свинца вызывает изменения в функциональном состоянии организма и обеспокоенность с точки зрения развития патологии, обусловленной экспозицией к наночастицам свинца. Полученные данные обосновывают необходимость дальнейших исследований, нацеленных на определение недействующей концентрации для наночастиц оксида свинца.