Применение культуры фибробластов крысы для оценки токсических свойств воды

Введение. В поверхностных водоемах протекают различные гидрологические, химические и биологические процессы, формирующие физико-химический состав воды. Вариативность показателей качества и безопасности воды является следствием смены сезонов, а также воздействия климатических и техногенных факторов. Однако по изменениям состава воды невозможно оценивать ее токсические свойства и риски для здоровья. Токсичность следует рассматривать как системное свойство воды в целом, а не какого-то одного показателя.

Попадающие в воду природные компоненты и поллютанты подвергаются биологической и химической трансформации, в частности процессам комплексообразования, вследствие чего меняется их растворимость и биодоступность [1–3]. Трансформация опасных загрязнителей в окружающей среде обычно приводит к образованию трудноидентифицируемых соединений. Вредное воздействие компонентов среды можно обнаружить биологическими методами [4]. Выявление наиболее опасных компонентов водной среды путем применения биомаркеров представляется перспективным направлением исследований. Биотестирование применяют при оценке эколого-токсикологической нагрузки на водоемы [5], изучении биомагнификации веществ в пищевых цепях [6]. Зачастую в качестве основного биоиндикатора для изучения аккумуляции веществ используют физиологические и поведенческие показатели гидробионтов [7]. В России действует ряд биологических методов контроля различных видов вод, водных вытяжек из почв и отходов^{1 2 3 4 5 6} с применением различных тестовых организмов. Тестовые организмы из разных таксономических групп отличаются особенностями метаболизма и обладают неодинаковой чувствительностью к химическим веществам, а показатели токсического эффекта выражаются в неоднородных единицах, например, в оптической плотности или проценте выживаемости организмов, что затрудняет сравнение полученных результатов биотестирования и их экстраполяцию в отношении организма человека. Как правило, токсичность в таких исследованиях оценивается только в отношении одного компонента, присутствующего в изучаемой среде. В свою очередь, препятствием при использовании теплокровных организмов в качестве тест-объектов считают большую стоимость исследований и трудности с соблюдением правил биоэтики [8].

Дополнением к существующим методам биотестирования может послужить использование культур клеток. Тесты на общую токсичность, направленные главным образом на выявление биологической активности тестируемых веществ, проводят на клеточных культурах, например фибробластах или раковых клетках [9]. Так, метод МТТ-теста является быстрым и доступным вариантом биотестирования. В основе метода заложена способность восстановления тетразолиевого красителя, которая зависит от клеточной метаболической активности и обусловлена NAD(P)H-зависимыми клеточными оксидоредуктазами [10]. МТТ-тест идеально подходит в качестве диагностического метода для оценки цитотоксичности компонентов различного состава, таких как микотоксины, пестициды, бактериальные культуры, изоляты плесневых грибов, продукты питания, корма, а также широкий спектр проб из объектов окружающей среды [11]. Таким образом, выбор биомаркера должен основываться на его чувствительности к изменяющимся свойствам воды. В дальнейшем открываются перспективы использования в качестве биомаркеров клеточных линий человека и показателей клеточного метаболизма, чувствительных к определенным соединениям из состава воды, а также использования токсичности в качестве интегрального показателя состояния водного объекта.

Цель исследования: апробация метода биотестирования общих показателей воды с использованием культуры клеток фибробластов крысы и регрессионной модели.

Материалы и методы. В 2020 и 2021 годах был осуществлен отбор проб воды из зарегулированного на реке водохранилища – источника питьевого водоснабжения крупного города Свердловской области. На разных участках этой реки расположен ряд гидроузлов, а исследуемое водохранилище находится вблизи действующих промышленных объектов. Органолептические и физико-химические показатели измерены стандартными методами. Концентрации углерода измерены методом высокотемпературного окисления, тяжелых металлов – методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой. Тяжелые металлы также обладают комплексообразующими свойствами [2], что может менять их растворимость и биодоступность в воде. Эксперимент проведен на культуре первичных клеток (фибробласты кожи крысы), полученных в соответствии с описанным протоколом [12]. Фибробласты выбраны в качестве объекта биотестирования ввиду их распространенности в организме в качестве основного компонента соединительной ткани и участии в тканевом гомеостазе [13], а также высокой скорости выращивания в качестве культуры. Количество жизнеспособных клеток в полученной культуре определяли с помощью счетчика клеток LUNA-II (Logos Biosystems, Корея). Перед посадкой клеточной культуры в планшеты для проведения эксперимента из суспензии клеток отбирали 20 мкл и смешивали с эквивалентным объемом красителя трипанового синего. Полученную суспензию переносили в одноразовый слайд для подсчета клеток в приборе. Жизнеспособность культуры составила около 80 %. Клетки высевали в 96-луночный планшет (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) и инкубировали в течение 24 часов в стандартных условиях до добавления анализируемых проб воды.

Для количественной оценки цитотоксического эффекта определяли дегидрогеназную активность фибробластов (МТТ-тест). Использовали желтый тетразолиевый краситель (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) (Sigma Aldrich, США), который восстанавливается в пурпурный формазан в живых клетках. В качестве растворяющего компонента использовали диметилсульфоксид (ДМСО). В каждую лунку с клетками добавляли по 20 мкл MTT красителя в концентрации 5 мг/дм3 и инкубировали в атмосфере 5 % CO2 при 37 °C в течение 2 часов. После этого из планшетов полностью удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО для растворения кристаллов формазана. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Epoch™ (BioTek, США) при длине волны 490 нм. Результаты рассчитывали по формуле:

где А490 нм – оптическая плотность образца при длине волны 490 нм, blank – оптическая плотность фона (культуральной среды).

На основании выборки из результатов трех опытов построена регрессионная модель зависимости дегидрогеназной активности (группирующая переменная) от физико-химических показателей с выбором наиболее значимых.

Результаты. В табл. 1 представлены результаты исследований физико-химического состава воды, в табл. 2 – результаты оценки токсических свойств воды.

Максимальные значения органолептических показателей цветности и мутности выявлены летом 2021 г. По показателю pH природная вода охарактеризована как слабощелочная. В зимнее время выявлены максимумы содержания сухого остатка, жесткости, нитрит- и нитрат-ионов, растворенного общего и органического углерода, растворенных форм меди, марганца и стронция. Увеличение концентрации железа (по сравнению с осенним сезоном) составило 1,7 раза зимой, 2,1 раза летом. Выявлены увеличения значений показателей в зимнее и летнее время (в сравнении с осенью):

по мутности – в 10 раз летом, нитрит-ионам – в 15 раз зимой, растворенному свинцу – десятикратное повышение концентрации летом. Не выявлено сезонных закономерностей между изменением значений показателей органического вещества – перманганатной окисляемости и растворенного органического углерода. Выявлены превышения установленных нормативных значений в воде⁷ по показателям: цветность, мутность, ПО.

Минимальные значения дегидрогеназной активности культуры клеток фибробластов выявлены при воздействии воды, отобранной в осенний сезон (табл. 2).

Получено уравнение регрессии, описывающее зависимость дегидрогеназной активности от комбинированного воздействия физико-химических показателей природной воды (R2 = 0,99; F(1,1) = 1440,8; p < 0,017; n = 3):

По результатам регрессионного анализа установлен наиболее значимый предиктор токсичности – растворенная форма железа.

Обсуждение. По результатам начатого мониторинга данного водоисточника установлена сезонная вариативность показателей, характеризующих ионный состав, кислотно-основные свойства воды, процессы поступления и трансформации органического вещества [14], что подтверждается текущими исследованиями. Каждый из этих показателей участвует в формировании физико-химических свойств воды и, как было предположено, оказывает влияние на ее токсичность. Наибольшие значения дегидрогеназной активности клеток выявлены летом, что может свидетельствовать о наиболее благоприятном влиянии физико-химическом состава воды на ее физиологические свойства. Из всех показателей физико-химического состава воды наиболее выраженное токсическое воздействие на фибробласты оказал фактор, не проявляющий экстремальных изменений в воде в разные сезоны года и не превышающий установленные нормативные требования, – растворенная форма железа. Железо также влияет на органолептические показатели воды (цветность, мутность) и комплексообразующую способность; лимитирующий показатель вредности – органолептичекий⁷. Вклад в содержание железа в водоемах Среднего Урала вносят подстилающие породы и сточные воды промышленных предприятий с повышенным содержанием данного элемента [15][16]. В Уральском регионе имеются железорудные месторождения [17], вследствие чего происходит повышение фонового содержания железа в почвах и грунтовых водах. Соединения железа аккумулируются на дне водных объектов. Вообще в процессах перераспределения химических соединений внутри осадка и в обмене с придонной водой участвуют в первую очередь реакционноспособные формы химических элементов, растворенные в иловой воде или переходящие в раствор (или в осадок) при соответствующем изменении условий [18]. Растворенная форма железа характеризуется более высокой биологической активностью, чем кристаллизованная. Содержание железа в водоисточниках выше допустимого уровня может привести к токсическим эффектам, влияя на метаболические реакции в живом организме [19]. При определенных условиях содержание ионов железа может стимулировать пролиферацию клеток. В эксперименте по воздействию раствора FeSO4 и FeCl3 (в концентрации от 50 до 100 мкм) наблюдали пролиферацию фибробластов за счет активного образования кислорода, опосредованного окислительно-восстановительной реакцией с участием железа, за счет присутствия ионов в самой среде, но не за счет доставки железа в клетки [20].

Железо в основном образует комплексы с растворенным органическим веществом в ионной форме, при этом на формирование соединений сильно влияет pH [21]. Известно, что под воздействием растворенных органических соединений увеличивается подвижность металлов [22][23]. Образующиеся металлорганические соединения могут быть более токсичными для биологических организмов по сравнению с ионной формой металлов⁸ [24]. Следовательно, в условиях невысокой концентрации растворенного железа, но при наличии достаточного количества лигандов может увеличиваться его биодоступность и токсичность. Наибольшее значение показателя «перманганатная окисляемость» выявлено осенью в сравнении с другими сезонами. Несмотря на отсутствие пикового значения концентрации растворенного органического углерода, уровень перманганатной окисляемости свидетельствует о преобладании в составе органических веществ доли легкоокисляемых (либо вновь поступивших в водоем) соединений. Вероятно, это способствует увеличению доли железа, связанного в комплексы и хелаты.

По результатам эксперимента можно заключить, что токсические свойства воды водохранилища в разные сезоны года определяются растворенной формой железа. При этом важна не концентрация, а сам показатель, играющий одну из ключевых ролей в клеточном метаболизме. Было выдвинуто предположение об усилении токсических свойств железа за счет взаимодействия с подвижными органическими лигандами либо доминирования в воде ионной формы железа в валентности, которая наиболее губительна для клеток.

Проведение скрининговых токсикологических исследований с использованием культур клеток позволит выявить чувствительные биохимические маркеры клеточного метаболизма, поможет выявить ткани и органы, подвергающиеся наибольшему токсическому воздействию. В дальнейшем переход к культурам клеток человека и выбора специфических биохимических показателей будет служить инструментом для идентификации наиболее опасных компонентов в составе воды.

Выводы

1. Проведены исследования физико-химических показателей воды, характеризующих ее качество и безопасность. Выявлена существенная вариативность показателей в разные сезоны года: по показателю «мутность» она составляет 10 раз, нитрит-ионам – 15 раз, а также десятикратное увеличение концентраций растворенного свинца.

2. Проведена апробация метода биотестирования воды на культуре клеток фибробластов крысы (МТТтест); показана чувствительность данного метода по отношению к компонентам физико-химического состава воды.

3. Установлены изменения клеточного метаболического ответа на состав воды в разные сезоны года. Минимальные значения дегидрогеназной активности культуры клеток выявлены при воздействии воды, отобранной в осенний сезон, а максимальные – в летний. Выявлен предполагаемый предиктор токсических свойств воды – растворенная форма железа.