Профилактика комбинированного цитотоксического действия наночастиц оксидов селена и меди в эксперименте

Введение. Известно, что при ряде производственных процессов, включая металлургические, образуются элементооксидные наночастицы (ЭО НЧ), которые вместе с субмикронными частицами тех же оксидов элементов размером более 100 нм загрязняют воздух рабочих помещений и атмосферы. Как литературные данные, так и экспериментальные исследования нашего коллектива свидетельствуют о том, что мелкодисперсные частицы обладают выраженным вредным воздействием на организм [1–3]. Наряду с техническими способами снижения загрязненности воздуха целесообразен поиск путей повышения устойчивости организма к указанному вредному действию. Эта стратегия, называемая нами биологической профилактикой, развивается научным коллективом ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП Роспотребнадзора на протяжении многих лет. Ранее были научно обоснованы и экспериментально апробированы способы повышения устойчивости к вредному действию наночастиц при их изолированной экспозиции (например, к наносеребру, нанозолоту, наноникелю, наномарганцу [4]) и в комбинации (например, к наномеди, наноцинку и наносвинцу [5]). В данной статье рассматриваются результаты эксперимента, в котором оценивалось влияние комплекса биологически активных веществ (биопрофилактический комплекс (БПК) – это комплекс биологически активных веществ, безвредных при длительном применении и повышающих устойчивость организма к токсическому воздействию химических загрязнителей производственной среды и среды обитания), обладающих антитоксическим действием при интратрахеальном введении комбинации наночастиц оксида селена (SeO) и оксида меди (CuO). Комбинация этих химических элементов встречается в составе загрязнителей воздуха при рафинировании меди и некоторых других производственных процессах, протекающих в электролизных, шламовых, медеплавильных цехах [6][7].

Материалы и методы. Суспензии исследуемых наночастиц (НЧ) были получены в Центре коллективного пользования «Современные нанотехнологии» Уральского федерального университета с помощью лазерной абляции тонких листовых мишеней соответствующего элемента 99,99 % чистоты в стерильной деионизированной воде (ДВ) по методике, описанной ранее [8].

Форма и размер частиц были охарактеризованы с использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и графиков распределения частиц по диаметру (d). Средний диаметр использованных наночастиц оксида селена составил (SeO НЧ) 51 ± 14 нм (рис. 1), оксида меди (CuO НЧ) – 21 ± 4 нм (рис. 2).

Стабильность суспензий характеризовалась величиной дзета-потенциала, измеренного с помощью анализатора Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical Ltd., UK), и была высокой (дзета-потенциал вплоть до 42 mV), что позволило путем частичного испарения воды при 50 °C повысить концентрацию суспензии до 0,25 г/л без изменения размера и химической идентичности ЭО НЧ.

Исследование проводилось на аутбредных белых крысах-самках. Масса животных учитывалась на начало эксперимента и составляла от 222,43 ± 1,48 г, при этом разброс составлял не более чем 20 %. Статистической значимой разницы по массам между группами не было.

Интратрахеальная инстилляция с помощью специальной воронки по 0,5 мл суспензий SeO НЧ и CuO НЧ в концентрациях 0,25 г/л НЧ («НЧ SeO + НЧ CuO») либо стерильной ДВ без частиц объемом 1 мл («Контроль») осуществлялась крысам под эфирным рауш-наркозом под контролем зрения. Половина животных обеих групп ежедневно на протяжении 4 недель, предшествующих интратрахеальной инстилляции, получала специальную диетическую добавку, содержащую БПК. Соответствующие группы крыс (по 10 особей в каждой) далее обозначаются «Контроль», «НЧ SeO + НЧ CuO», «НЧ SeO + НЧ CuO + БПК», «ДВ + БПК».

В состав испытанного БПК входили следующие компоненты:

• в питье, которое полностью заменяло бутилированную воду: 1,5 % раствор глутамата натрия;
• в корме (дозировка указана из расчета на одно животное): глицин (12 мг), рутин и витамин С (по 1,4 мг), смесь омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (с преобладанием докозагексаеновой кислоты не менее 45 % и эйкозапентаеновой кислоты не менее 40 %, общим объемом 13,3 мг), ретинол (1,3 мкг), цианкоболамин (0,69 мкг), витамин D3 (холекальциферол, 1,04 мг).

Этот состав базировался на литературных и собственных данных о патогенетических, защитно-компенсаторных механизмах развития интоксикаций, а также о благоприятном воздействии биологически активных веществ на эти механизмы с учетом токсикодинамических и токсикокинетических эффектов упомянутых ЭО НЧ [8][9].

Бронхоальвеолярный лаваж проводился спустя 24 часа после инстилляции. У крыс под гексеналовым наркозом в препарированную трахею вводилась канюля, соединенная со шприцем Люэра, содержащим 10 мл физиологического раствора. Жидкость поступала в легкие медленно под тяжестью поршня при вертикальном положении животного и шприца. Затем крыса и шприц поворачивались на 180°, и бронхоальвеолярная лаважная жидкость (БАЛЖ) частично перетекала обратно в шприц. Объем БАЛЖ фиксировали, БАЛЖ помещалась в охлажденные пробирки.

Аликвотная проба БАЛЖ набиралась в меланжер для белых кровяных телец вместе с метиленовым синим, растворенным в 3 % уксусной кислоте. Подсчет общего числа клеток велся с помощью камеры Горяева при оптической микроскопии. Остальной объем БАЛЖ центрифугировали в течение 4 мин при 200 г, затем жидкость декантировалась, а из осадка готовились мазки на два предметных стекла. После просушивания на воздухе мазки фиксировались метиловым спиртом и окрашивались азур-эозином. Мазки микроскопировались с иммерсией при увеличении ×1000. Дифференциальный подсчет для определения процента альвеолярных макрофагов (АМ), нейтрофильных лейкоцитов (НЛ) и прочих клеток проводился до общего числа подсчитан ных клеток, равного 100. С учетом общего числа клеток в БАЛЖ эти проценты пересчитывались на абсолютное число AM и НЛ.

Активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) в надосадочной жидкости после центрифугирования БАЛЖ оценивалась на анализаторе Cobas Integra 400 plus (Roche Diagnostics GmbH) с использованием соответствующего диагностического набора ASTIFCC (Roche Diagnostics GmbH).

Статистическая значимость межгрупповых различий средних значений оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты. Под влиянием наночастиц оксидов селена и меди отмечается статистически значимое увеличение общего числа клеток БАЛЖ в сравнении с контролем. Как показано в таблице, это увеличение происходило преимущественно за счет возрастания числа НЛ. Под влиянием БПК в группе «НЧ SeO + НЧ CuO + БПК» основные цитологические характеристики БАЛЖ – общее число клеток, число НЛ и отношение НЛ/АМ – были существенно снижены в сравнении с соответствующими показателями группы «НЧ SeO + НЧ CuO».

Наряду с этим при интратрахеальном введении комбинации наночастиц оксидов селена и меди в надосадочной жидкости БАЛЖ отмечалось статистически значимое увеличение содержания АСТ. Этот показатель в группах «НЧ SeO + НЧ CuO + БПК» и «ДВ + БПК» не отличался от контроля (рис. 3).

Обсуждение. Показатели, представленные в таблице, служат многократно испытанным критерием сравнительной количественной оценки цитотоксического действия различных частиц. Известно, что мобилизация АМ, и в еще большей степени НЛ, регулируются продуктами разрушения макрофагов, происходящего под действием фагоцитируемых ими цитотоксичных частиц. Повышение соотношения НЛ/АМ является косвенным, но высокоинформативным показателем цитотоксического действия любых интратрахеально введенных или ингалированных малорастворимых частиц, поскольку его увеличение связано с преобладающей мобилизацией НЛ в ответ на действие продуктов разрушения АМ [8][9].

Снижение в группе «НЧ SeO + НЧ CuO + БПК» основных цитологических характеристик БАЛЖ (общее число клеток, число НЛ и, главным образом, отношение НЛ/АМ) может свидетельствовать об ослаблении цитотоксического действия изученной комбинации наночастиц оксидов селена и меди после проведения предварительного курса биологической профилактики. По числу АМ отмечается недостаточно статистически значимая, но благоприятная тенденция, отмечено некоторое их повышение в группе «НЧ SeO + НЧ CuO» и последующее снижение в группе «НЧ SeO + НЧ CuO + БПК».

Практически все цитологические показатели у крыс, получавших только БПК, не отличались от контрольных значений. Исключение составляет соотношение НЛ/АМ, статистически значимое повышение которого произошло за счет недостоверного снижения АМ, но не увеличения НЛ. Предположительно, полученный эффект можно объяснить большой дисперсией числа АМ в БАЛЖ.

Снижение активности АСТ в БАЛЖ можно считать благоприятным действием входящих в состав БПК веществ, которые могли оказать прямой и опосредованный мембраностабилизирующий эффект.

Такое снижение цитотоксического действия обусловлено сложными механизмами защитного действия входящих в комплекс биопротекторов. Витамины способствуют повышению неспецифической сопротивляемости организма, а также оказывают корригирующее действие на обменные процессы. Витамин В12 был включен в качестве компонента, согласно литературным данным [10][11], способствующего снижению вредного действия селена. Особое значение имеет мембраностабилизирующее действие глутамата натрия, поскольку оно может препятствовать повреждению митохондрий и тем самым – оксидативному стрессу, являющемуся, по современным представлениям, одним из основных механизмов цитотоксического действия. Для подавления окисления липидов в состав комплекса нами был включен жирорастворимый антиоксидант – витамин А [12]. Воспалительная реакция, помимо мобилизации нейтрофильных лимфоцитов (НЛ) в рамках реализации естественного механизма самоочищении легких от ЭО НЧ, может быть также опосредована медью, вызывающей острые воспалительные изменения легочной ткани [1][13][14]. Воспалительный ответ способны подавлять такие компоненты БПК, как омега-3 ПНЖК [15], витамин D3 [16], рутин [17][18], витамин С [19][20]. Большое значение, по нашему мнению, имеют разные молекулярные механизмы антиоксидантного действия, в той или иной степени присущие ряду биопротекторов заявляемого комплекса (антиоксидантный синергизм).

Заключение. Однократное интратрахеальное введение комбинации суспензий наночастиц оксидов селена и меди вызвало изменения цитотоксических и биохимических характеристик бронхоальвеолярной лаважной жидкости, характерных для действия типичных цитотоксичных частиц.

Научно обоснованный и испытанный нами в эксперименте биопрофилактический комплекс существенно ослабил это цитотоксическое действие ЭО НЧ. Большое значение, по нашему мнению, имеет разное по молекулярным механизмам антиоксидантное действие, в той или иной степени присущее ряду биопротекторов изученного комплекса (антиоксидантный синергизм).

Данный биопрофилактический комплекс может быть использован в качестве способа минимизации рисков производственной и окружающей среды для здоровья населения, подверженного комбинированному воздействию ЭО НЧ.