Введение. Возбудитель холеры находится в процессе постоянной эволюции, и поэтому практически каждая крупная вспышка инфекции вызывается генетически отличающимися вариантами. На территории Российской Федерации неоднократно регистрировали завозы токсигенных холерных вибрионов, однако распространения среди людей удавалось избежать благодаря своевременному проведению комплекса мероприятий. Условием обеспечения адекватного ответа является быстрое определение эпидемического потенциала каждого свежевыделенного штамма, включающее выявление полного спектра уникальных генетических маркеров, позволяющих установить происхождение конкретного возбудителя.

В настоящее время описано много генетических детерминант, позволяющих судить о патогенном потенциале вибрионов: аллельный профиль генов субъединицы В холерного токсина (ctxB) и структурной единицы токсин-корегулируемых пилей адгезии (tcpA), структура острова пандемичности VSP-II, гены дополнительных токсинов, ICE-элементы, островок VcB, набор уникальных SNP и ряд других [1–5]. Однако быстрое и одномоментное выявление столь большого числа генетических маркеров представляет определенные трудности. Наиболее информативен метод полногеномного секвенирования с последующим биоинформационным анализом, но его использование в оперативных целях затруднено. Для оперативного анализа наиболее пригоден метод ПЦР, позволяющий получить информацию о наличии конкретных генетических детерминант в течение нескольких часов с момента выделения культуры.

Показателем интереса исследователей является число депонированных нуклеотидных последовательностей в международных базах данных. Так, если 2019 году в базу NCBI было добавлено 442 генома холерных вибрионов, то в 2020 г. – уже 1872 генома, из которых 1697 – в декабре 2020 г. Этот массив данных открывает возможность для биоинформационного анализа.

По результатам анализа установлено, что геном V. cholerae обладает высокой пластичностью и поэтому штаммы, вызвавшие крупные вспышки в последнее время (Гаити, Йемен), отличаются рядом уникальных маркеров [3–5].

Первые геноварианты отличались от типичных штаммов Эль Тор только наличием гена ctxB1 классического типа (вместо ctxB3 типа Эль Тор). В дальнейшем им на смену стали приходить штаммы, содержащие сразу 2 отличных от типовых маркера: аллель tcpACIRS101 вместо tcpAEl Tor и гена rtxA, кодирующего синтез высокомолекулярного цитотоксина-актиномодулятора MARTX, с null-мутацией, приведшей к формированию преждевременного стоп-кодона. Этот аллель с укороченной ORF был обозначен Dolores, Satchell [3][6] как rtxA4. Такие штаммы мы условно называем «предгаитянскими», поскольку они, по всей видимости, являются предшественниками т.н. «гаитянских» штаммов, которые приобрели новый аллель ctxB7. Последний сформировался на фоне генотипа tcpACIRS101rtxA4. С 2010 г. после крупномасштабной эпидемии в Гаити началось их стремительное распространение по всему миру. Наконец, в последнее время наметилась тенденция к замещению «гаитянской» линии «постгаитянской», представители которой содержат еще более укороченный rtxA за счет делеции 60 пар нуклеотидов (п.н.) в проксимальной части гена в дополнение к null-мутации на дистальном конце; этот аллель обозначен как rtxA4a [3]. Позднее для «гаитянских» штаммов была описана делеция 8 п.н. в гене VCA1095 [7]. Он локализован в составе кластера хемотаксиса III на малой хромосоме и кодирует гистидинкиназу CheA-3 [8–10]. Две указанные делеции рассматриваются как перспективные маркеры токсигенных штаммов холерного вибриона, распространившихся в течение последних нескольких лет [3][7]. Однако это предположение высказано на основании исследования ограниченного числа штаммов.

Цель исследования: создание на основе биоинформационного анализа базы данных полногеномных сиквенсов V. cholerae, содержащих разные аллели генов cheA3 (VCA1095) и rtxA, и разработка простой и информативной схемы типирования токсигенных вибрионов.

Материалы и методы. Для анализа использовали полученные из базы NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) результаты полногеномного секвенирования 3309 штаммов холерных вибрионов, выделенных в период 1962–2021 гг. Наименования генов и позицию INDEL-маркера VCA1095 указывали по референсному геному штамма V. cholerae N16961 (GenBank Accession Number NC002505.1 и NC002506.1). Сборку геномов, представленных в виде ридов, проводили с использованием программы Spades [1][7]. Программное обеспечение разрабатывали на языке программирования Java. Кластерный анализ проводили с использованием авторского программного обеспечения по методу UPGMA. Сведения о свойствах штаммов (дате, месте выделения) брали из аннотаций к сиквенсам.

Результаты. Первым этапом работы было создание локальной базы данных геномов на основе поиска в NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). База включала 3309 геномов, 10 из которых были представлены в виде набора ридов. При этом до 2010 г. было выделено 1032 штамма, а начиная с 2010 г. изолировано 2277 штаммов.

Как установлено ранее, делеция 8 п.н. в гене cheA3 (VCA1095) приводит к формированию в ПЦР фрагмента длиной 87 п.н., обозначенного авторами как «гаитянский» маркер VCA1095-87 в противовес прототипному фрагменту размером 95 п.н. – маркер VCA1095-95 [7]. В локальной базе выявлено 583 штамма, несущих «гаитянский» маркер VCA1095-87. Все штаммы обладали генами холерного токсина, имели идентичный INDEL-генотип [11], характерный для токсигенных штаммов, и содержали ICE-элемент «индийского» типа [2]. До 2010 г. распространение штаммов с «гаитянским» маркером VCA1095-87 имело единичный характер: восемь штаммов выявлено в Индии и один в Китае. Резкий подъем заболеваемости холерой, вызванной штаммами вибрионов с маркером VCA1095-87, был отмечен начиная с 2010 г. (табл. 1). При этом данным маркером обладали все 266 представленных в NCBI штаммов, выделенных собственно в Гаити за период 2010–2017 гг. В последующем штаммы с маркером VCA1095-87 выделялись ежегодно при всех крупных вспышках.

Первый токсигенный штамм с аллелем rtxA4a был выделен в 2012 г. в Индии, в этом же году такой штамм был завезен из Индии в РФ [3]. Всего выявлено 135 штаммов, несущих аллель rtxA4a и маркер «гаитянского» типа VCA1095-87. Распределение штаммов, несущих одновременно «гаитянский» маркер VCA1095-87 и rtxA4a, приведенное в табл. 1, показывает их несколько меньшее распространение по сравнению со штаммами с VCA1095-87 и rtxA4. Интересно отметить, что ни одного штамма с маркером rtxA4a не было выделено в Гаити, несмотря на продолжение вспышки до 2017 г. и на достаточно широкое распространение подобных штаммов по всему миру. Это свидетельствует в пользу отсутствия повторных заносов холеры в Гаити в последующие годы.

Начиная с 2012 г. штаммы с маркерами VCA1095-87 и rtxA4a ежегодно выделялись на территории Индии, что свидетельствовало об их укоренении, причем это укоренение сопровождалось неоднократными заносами в другие регионы мира. Самой крупной вспышкой, вызванной этим типом, явились события в Йемене, когда все штаммы одновременно несли оба изучаемых признака. Учитывая клональную природу вспышки в Йемене [12], полученные данные на наш взгляд позволяют рассматривать вибрионы, несущие одновременно маркеры VCA1095-87 и rtxA4a, как «постгаитянский» тип. В этом случае группу, условно названную «предгаитянской», сформировали штаммы, несущие VCA1095-95 и rtxA4. Штаммов, имеющих сочетание VCA1095- 95 и rtxA4a, не обнаружено.

Описанный подход был апробирован нами для анализа выборки объемом 471 штамм холерного вибриона серогруппы О1, выделенных, по сведениям GenBank, начиная с 2015 г. По данным биоинформационного анализа, 357 штаммов содержали профаг CTX, остров патогенности VPI, островок VcB, ICE-элементы и характеризовались INDEL-генотипом, типичным для токсинпродуцирующих культур [1–4][11], что позволяет отнести их к штаммам третьей волны седьмой пандемии [4, 5].

По результатам анализа выборки токсигенных штаммов установлено, что «гаитянские» VCA1095-87 rtxA4 штаммы выделялись на Гаити до 2017 г. и в Индии (2015 г.), а также во многих других странах вплоть до 2018 г. (табл. 1). В 2019 г. в Англии от людей было изолировано 27 штаммов данного типа (при этом информация о характере вспышки в литературе отсутствует). Очевидно, это обусловлено тем фактом, что вытеснение линий происходит очень постепенно. Тем не менее штаммы, циркулировавшие в мире до появления «предгаитянской» группы, содержащие VCA1095- 95 и прототипный аллель rtxA1 (без null-мутации), а также ctxB1 и tcpAEl Tor, на настоящий момент практически утратили актуальность и встречаются редко, вызывая лишь спорадические либо групповые случаи [3, 12], поэтому не были включены в наше исследование.

Согласно предложенной классификации «постгаитянские» штаммы, помимо Йемена, в период 2015–2020 гг. неоднократно выделялись в Бангладеш, Индии, Танзании, Кении, Китае и Зимбабве [13]. Штаммы, относящиеся к «предгаитянскому» типу, в настоящее время циркулируют в Бангладеш, о чем свидетельствует их практически ежегодное выделение в Конго (2015–2017 гг.), отмечены их заносы в Танзанию, Уганду (2015 г.), Катар, Судан (2017 г.), Анголу (2018 г.) [14–17]. Предлагаемая классификация, на взгляд авторов, имеет большое значение, поскольку результаты ежегодного мониторинга за холерой свидетельствуют о высоком эпидемическом потенциале холерного вибриона и сохранении постоянной угрозы заноса холеры на территорию Российской Федерации [18–21].

Обсуждение. На основании проведенной работы по наличию двух генетических детерминант мы предлагаем разделить все токсигенные штаммы, представляющие третью волну [4][13], на три группы: «предгаитянскую», «гаитянскую» и «постгаитянскую». Данная классификация проста и понятна и может служить хорошим дополнением к имеющейся классификации, основанной на детекции различных аллелей гена ctxB.

Ранее было показано, что «предгаитянские» штаммы приобрели сразу 2 маркера – tcpACIRS и rtxA4, сохранив аллель ctxB1, и высказано предположение о том, что способность к синтезу холерного токсина классического типа сделало излишним энергозатратное функционирование высокомолекулярного MARTX, и продукт усеченного гена утратил биологическую активность. На этом фоне возник аллель ctxB7 [6] – маркер «гаитянской» линии. Одновременно с ним нами установлено появление усеченного гена cheA3 (VCA1095-87) за счет сдвига рамки считывания и формирования преждевременного стоп-кодона в результате делеции 8 п.н. [7]. Мы не исключаем, что продукт этого гена, подобно продукту rtxA4, также утратил свойственную ему активность в целях энергосбережения для успешного размножения, тем более что, согласно данным Gosink и соавт. [8], он не оказывает существенного влияния на хемотаксис (в отличие от его гомолога СheA2 – продукта гена VC2063 в составе большой хромосомы). Наконец, дополнительная делеция 60 п.н. в гене rtxA4 привела к дальнейшему укорочению MARTX и образованию аллеля rtxA4a – маркера «постгаитянской» линии [3].

Заключение. Результаты проведенного нами анализа большой выборки геномов эпидемических штаммов холерных вибрионов позволили установить, что «предгаитянские» штаммы всегда содержат аллель ctxB1 и прототипный cheA3 (VCA1095-95), тогда как у «гаитянских» присутствует обязательное сочетание ctxB7 и «гаитянского» cheA3 (VCA1095- 87), а «постгаитянские» отличаются от последних содержанием аллеля rtxA4a.

Поскольку определение аллелей ctxB, tcpA и rtxA связано с применением MAMA-ПЦР [14–16], постановка которой представляет определенные трудности, мы сочли возможным для оперативного анализа использовать два маркера, что сократит материальные, трудовые и временные затраты. Выявление двух маркеров VCA 1095-87 и rtxA4a не представляет особой сложности и может быть оперативно проведено в течение нескольких часов с момента выделения чистой культуры. Кроме того, ранее нами уже разработан способ детекции с помощью ПЦР в формате реального времени по конечной точке прототипного и «гаитянского» аллелей гена cheA3 (VCA1095-95 и VCA1095-87), который может быть проведен в течение менее двух часов [17]. На наш взгляд, разработка подобного способа идентификации делеции 60 п.н. в гене rtxA4а в таком же формате не представляет особой сложности. Таким образом, предлагаемая схема типирования токсигенных вибрионов по выявлению двух маркеров VCA 1095-87 и rtxA4a в дальнейшем может быть с успехом применена для оперативного анализа свежевыделенных культур.