Введение. Vibrio cholerae nonO1/nonO139 (НАГвибрионы) обнаруживаются в различных экологических нишах – прибрежных водах, озерах, водоемах и являются их естественными обитателями. Заражение вибрионами nonO1/nonO139 серогрупп может вызывать легкие желудочно-кишечные заболевания, раневые или ушные инфекции у здоровых людей. Среди людей с ослабленным иммунитетом они могут стать причиной тяжелых раневых инфекций или сепсиса и связаны с высоким уровнем смертности [1–4]. Особое внимание привлекают случаи инфицирования желчных путей НАГ-вибрионами, что является причиной первичной септицемии, перитонита [5].

В последнее время появились сообщения об участившихся случаях заболеваний, вызванных V. cholerae nonO1/nonO139 во многих странах, возникающих при купании в морской воде [6][7] и пресноводных озерах [8–10]. Штаммы V. cholerae nonO1/nonO139 все чаще признаются в качестве потенциального этиологического агента, имеющего одинаковую нишу с патогенными штаммами [11][12].

В литературе встречаются многочисленные данные о множественной лекарственной устойчивости клинических штаммов V. cholerae O1 и O139 [13][14] и экологических изолятов, относящихся к V. cholerae nonO1/nonO139, выделяемых из внешней среды [15].

Геном холерных вибрионов nonО1/nonO139 серогрупп содержит специализированные мобильные элементы, которые несут гены антибиотикорезистентности, способные передаваться между штаммами [16][17]. Наличие мобильных генетических элементов и мегаинтегрона создает благоприятные условия для горизонтального переноса генов от штамма к штамму и не исключает дальнейшего нарастания числа резистентных микроорганизмов, поскольку водные экосистемы обеспечивают подходящую среду для распространения устойчивости к противомикробным препаратам.

Изменение водных экосистем в результате антропогенного воздействия влияет на формирование устойчивости к антибиотикам региональных водных микроорганизмов [18]. В связи с этим мониторинг устойчивости к противомикробным препаратам популяций V. cholerae nonO1/nonO139 в окружающей среде, циркулирующих на конкретных территориях, имеет большое значение для прогнозирования и предотвращения заболеваемости, а также эффективного выбора средств этиотропной терапии [11].

Цель настоящего исследования – изучение резистентности к антибактериальным препаратам изолятов V. cholerae nonO1/nonO139, полученных в процессе ежегодного мониторинга холеры Референс-центром Ростовского-на-Дону противочумного института в 2019–2020 гг.

Материалы и методы. Штаммы V. cholerae nonO1/nonO139 были изолированы из стационарных точек водоемов г. Ростова-на-Дону в рамках ежегодного мониторинга холеры в 2019–2020 гг. Выделение культур из поверхностных водоемов, изучение биохимической активности и культурально-морфологических свойств, а также постановку тестов внутривидовой дифференциации проводили в соответствии c актуальными нормативно-методическими документами: МУК 4.2.2218–071; МУК 4.2.2870–112.

Проводили масс-спектрометрический анализ для полной ускоренной идентификации микроорганизмов, используя MALDI-TOF масс-спектрометр Microflex (Bruker Daltonics). Обработку, анализ и запись масс-спектров осуществляли в соответствии с МР 4.2.0089–143 с помощью программного обеспечения фирмы Bruker Daltonics: flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11).

Чувствительность/устойчивость НАГ-вибрионов к антибактериальным препаратам (АБП) проводили методом серийных разведений в агаре Мюллера – Хинтона рН (7,3 ± 0,2) HiMEDIA. Интерпретацию результатов антибиотикорезистентности вибрионов к АБП проводили в соответствии с МУК 4.2.2495–094. Антибактериальные препараты для экстренной профилактики и лечения холеры подбирали в соответствии с рекомендациями.

Для контроля качества антибактериальных препаратов и питательных сред использовали референтные тест-штаммы V. cholerae non О1 КM 162 (P 9741), Escherichia coli ATCC 25922.

С помощью стандартных средств программы Microsoft Office Excel проводили статистическую обработку результатов.

По методу Уилсона оценивали доверительные интервалы для доли полирезистентных штаммов (при доверительной вероятности p ≥ 0,95). Достоверность различия выборочных долей оценивали с помощью двустороннего z-теста (при уровне значимости α ≤ 0,05).

Мониторинг контаминации объектов окружающей среды холерными вибрионами как О1, так и не О1 групп является составляющей эпидемиологического надзора за холерой. Изучение вибриофлоры в стационарных точках открытых водоемов Ростовского региона проводится ежегодно с мая по октябрь во ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора».

В настоящей работе проанализированы результаты изучения чувствительности/устойчивости к АБП 350 штаммов V. cholerae nonO1/nonO139, выделенных из объектов окружающей среды в 2019 г. (263 штаммов) и 2020 г. (87 штаммов). Выделение и идентификацию культур холерных вибрионов проводили в соответствии со схемой лабораторной диагностики [19]. Видовую принадлежность проводили с помощью биохимических тестов, дополнительно используя метод MALDI-TOF MS.

Этот метод позволил успешно идентифицировать изоляты V. cholerae до видового уровня с высокой достоверностью. Для дальнейшей дифференциации было проведено серотипирование выделенных штаммов сыворотками диагностическими агглютинирующими O1, O139. Серологическую идентификацию V. cholerae nonO1/nonO139 проводили в реакции «слайд – агглютинации» c помощью набора сывороток диагностических холерных неО1/неО139 серогрупп моноспецифических кроличьих против типовых штаммов холерных вибрионов различных (О2–О84) серогрупп. Результаты. Все исследуемые штаммы были типичными представителями вида V. cholerae, не токсигенными (содержали гены hlyA, но не содержали гены wbe-, wbf-, ctxA, tcpA-).

Изучаемые культуры V. cholerae nonO1/nonO139 были протестированы на чувствительность/устойчивость к широкому спектру противомикробных препаратов (табл. 1).

Из 263 изолятов НАГ-вибрионов, выделенных в 2019 году, наибольшее число резистентных штаммов было зарегистрировано к ампициллину – 103 (39,2 %), рифампицину – 82 (31,2 %), налидиксовой кислоте – 68 (25,9 %) и фуразолидону – 53 (20,2 %). Эти штаммы были классифицированы как лекарственно устойчивые (R).

Чувствительность (S) к гентамицину и доксициклину показали все изоляты, выделенные в 2019 г. Один штамм (0,4 %) был устойчив к тетрациклину, два (0,8 %) – к ципрофлосакцину, четыре – к цефотаксиму (1,5 %). Девять изолятов показали устойчивость к ко-тримоксазолу (3,4 %), к левомицетину были устойчивы 8 штаммов (3 %), к стрептомицину – 8 (3 %).

В 2020 году доля штаммов V. cholerae nonO1/ nonO139, резистентных к ампициллину, составила 98,8 %. Устойчивость к фуразолидону зарегистрирована в 28,7 % случаев, налидиксовой кислоте – на уровне 26,4 %. Холерных вибрионов, резистентных к гентамицину, доксициклину, тетрациклину, ципрофлоксацину, в 2020 г. не было обнаружено.

При сравнении долей штаммов холерных вибрионов, устойчивых к разным классам АБП, в 2019 и 2020 гг. зарегистрированы статистически значимые изменения к ампициллину, цефотаксиму и рифампицину. Доля резистентных к ампициллину штаммов возросла с 60,8 до 98,8 %, к цефотаксиму изменилась с 1,5 до 5,7 %, к рифампицину снизилась с 31,2 до 8,0 % (при доверительной вероятности p ≥ 0,95). Все исследуемые вибрионы сохранили чувствительность к гентамицину и доксициклину. К остальным АБП зафиксированы незначительные изменения доли резистентных штаммов.

В 2019 году 29,3 % штаммов V. cholerae nonO1/ nonO139 обладали чувствительностью ко всем АБП, 38,4 % являлись монорезистентными, обнаружены фенотипы резистентности к двум АБП (16,0 %) (табл. 2). Термин «множественная лекарственная устойчивость» использовался нами для изолятов, которые устойчивы по меньшей мере к трем различным классам антимикробных препаратов [20]. Доля таких штаммов в нашем исследовании составила 27,4 %.

В 2020 г. чувствительных и монорезистентных штаммов V. cholerae nonO1/nonO139 обнаружено не было, резистентные к 2 АБП выделялись в 43,7 % случаев. Доля полирезистентных штаммов составила 56,3 %. Сравнение данных, полученных в 2019–2020 гг., указывает на статистически достоверное увеличение доли полирезистентных штаммов (z = 4,9; p < 0,0001).

Во многих регионах отмечается нарастание резистентности V. cholerae nonO1/nonO139 к ампициллину, ципрофлоксацину, налидиксовой кислоте и сульфаметоксазолу/триметоприму, а также числа полирезистентных штаммов [22–25].

Результаты исследований, проведенных в 2019 и 2020 гг., были внесены в пополняемую базу данных «Фенотипы антибиотикорезистентности холерных вибрионов различных серогрупп, выделенных на территории Ростовской области» (свидетельство о регистрации № 2017621303 от 14 ноября 2017 г.), которая ежегодно обновляется в рамках эпидемиологического мониторинга за холерой. Это позволяет оперативно анализировать динамику изменений регионального уровня антибиотикорезистентности.

Анализ фенотипических профилей антибиотикорезистентности штаммов V. cholerae nonO1/ nonO139, исследуемых в предыдущие годы (2016, 2017, 2020 гг.), показал, что чувствительных ко всем тестируемым антибиотикам вибрионов не выявлено. В 2018 г. таких штаммов было выделено 2,2 %, в 2019 г. – 29,3 % [21]. Доля полирезистентных штаммов колебалась с 19,8 % в 2016 г., в 2017 г. – 22,6 %, 2018 г. – 30 %, 2019 г. – 27,4 %. В 2020 г. доля таких штаммов возросла и составила 56,3 % (рисунок). Проведенный мониторинг показал достоверное увеличение доли полирезистентных штаммов V. cholerae nonO1/nonO139, выделенных из поверхностных водоемов, что показывает нарастающее влияние антропогенных факторов на окружающую среду и свидетельствует о санитарно-эпидемиологическом и экологическом неблагополучии гидроэкосистем г. Ростова-на-Дону.

Обсуждение. Экологические места обитания – реки, озера и другие водоемы – являются идеальной средой для передачи маркеров устойчивости к АБП среди микроорганизмов. Взаимодействие антибиотикоустойчивых бактерий с автохтонной микрофлорой способствует селекции штаммов и преобладанию устойчивых бактерий, приводящему к глобальному нарушению экосистемы [26]. Проведенные ранее исследования видового разнообразия и структуры микробных сообществ водоемов г. Ростова-на-Дону показали, что микрофлора водоемов представлена микроорганизмами разных таксономических групп с высокой долей полирезистентных штаммов [27].

Холерные вибрионы nonO1/nonO139, являясь автохтонными представителями водоемов, обладают исключительной способностью быстро приспосабливаться к меняющимся условиям среды. Возникновение устойчивости к антибиотикам является естественным эволюционным процессом, и такие факторы, как плотность микробного сообщества, использование антибиотиков в здравоохранении и животноводстве, могут влиять на частоту появления полирезистентных штаммов [28].

Заключение. Выделение из водных объектов г. Ростова-на-Дону большого числа полирезистентных изолятов V. cholerae nonO1/nonO139 свидетельствует о необходимости дальнейших мониторинговых исследований для понимания распространения резистентности к АБП среди микроорганизмов, поскольку появление устойчивости к часто используемым и рекомендуемым для лечения препаратам может влиять на национальные стратегии борьбы с холерой в случае возникновения чрезвычайных ситуаций.

1. МУК 4.2.2218–07 «Лабораторная диагностика холеры» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 31 мая 2007 г.). Доступно по: https://base.garant.ru/4185509/. 2. МУК 4.2.2870–11 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий террито- риального, регионального и федерального уровней» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 25.05.2011). 3. МР 4.2.0089–14 «Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей I–II групп патогенности» (утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 24 апреля 2014 г.). 4. МУК 4.2.2495–09 «Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам». Москва: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. 59 с.