Введение. Одним из ключевых направлений совершенствования сельского хозяйства является разработка эффективных средств защиты растений, отпугивающих или убивающих чужеродные организмы, помогая сохранить урожай [1]. Первые систематизированные исследования по разработке методов использования химических веществ в сельском хозяйстве начались еще в XIX веке с применения в защитных целях соединений мышьяка.

Первое протравливание семян с использованием ртутьорганических соединений в начале XX века в Германии способствовало росту использования веществ, содержащих тяжелые металлы, в качестве средств защиты растений [2]. Пестициды, содержащие в качестве действующего вещества тяжелые металлы, делятся на два основных подкласса: органические и неорганические.

К органическим пестицидам относят ртутьи оловоорганические соединения. При этом использование ртутьорганических веществ строго ограничено в большинстве стран вследствие их высокой токсичности. Их применение возможно только при обработке семян от бактериальных и грибковых заболеваний. Оловоорганические пестициды позиционирующиеся как фунгициды, бактерициды и акарициды [3], могут применяться в качестве антисептиков, однако тоже подлежат строжайшему контролю из-за высокой вредности. Особенным подклассом неорганических пестицидов, содержащих металлы, являются нанопестициды на основе частиц серебра, обладающие антимикробным эффектом. Однако их поведение в окружающей среде малоизучено, поэтому в настоящее время препараты этого класса не нашли широкое применение.

Наиболее часто сейчас в качестве средств защиты растений используются различные соединения меди. Они являются востребованными при борьбе с такими заболеваниями, как мучнистая роса, монолиоз, бактериоз и т. д. [4]. Пестициды, производимые на основе меди, обладают контактным действием и обычно наносятся до начала прорастания спор патогенов, так как эффективны только на поверхности растений [5]. Соединения меди вызывают денатурацию белка грибов и, соответственно, гибель микроорганизмов. Наибольшую распространенность получили препараты на основе сульфата, гидроксида и оксихлорида меди [6][7]. Препараты на основе меди могут обладать местным раздражающим действием, однако при этом ее сложно отнести к токсичным элементам.

Медь является необходимым элементом, входящим в состав гормонов, витаминов, ферментов, участвующим во множестве биохимических процессов. Недостаток меди может приводить к нарушениям гемоглобинобразования, угнетению сердечной деятельности, потере прочности костей, нарушениям обмена липидов. При этом повышенные концентрации меди в организме тоже несут за собой неблагоприятные последствия, в число которых входят расстройства нервной системы, ухудшение функции почек и печени, анемия и т. д. [7–9]. Медь является кофактором супероксиддисмутазы – фермента, участвующего в процессе перекисного окисления липидов [10]. Соответственно, избыток или недостаток этого микроэлемента может приводить к недостаточной или избыточной нейтрализации активных форм кислорода.

Активность накопления меди в организме зависит от различных факторов. Например, абсорбция меди усиливается при приеме животного белка. Также абсорбция ионов меди значительно интенсивнее происходит из солей (сульфатов, хлоридов и т. д.) [11].

При проведении гигиенических исследований интерес представляет информация об избыточном накоплении меди в растениях именно за счет применения конкретной препаративной формы медьсодержащего пестицида.

Традиционным методом контроля за содержанием металлов в растениях является метод атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС) как наиболее удобный, точный и экспрессный в отношении указанных объектов [12]. При этом аналитическая задача измерения содержания меди в объектах растительного происхождения сводится в основном к переводу образца в раствор и непосредственно анализу. Следует отметить, что вывод о повышенных содержаниях аналита, обусловленных обработкой агрохимическими препаратами, делается косвенно, на основании различий в содержании элемента в опытных и контрольных образцах. В качестве контрольных обычно выступают образцы, отобранные с участков, не подвергавшихся обработке.

Однако интерпретация полученных результатов может сильно осложняться за счет неоднородности структуры разлагаемого образца, находящей отражение в увеличении разброса при анализе параллельных проб, снижающей достоверность получаемых результатов.

Проблема гетерогенности образцов в действующих нормативно-методических документах решается за счет измельчения пробы в ступке после ее предварительного высушивания. Процедура позволяет добиться измельчения пробы, однако при попытке гомогенизации образцов с высоким содержанием влаги или при наличии других осложняющих факторов – семян в составе, плотной кожуры, необходимости увеличения массы навески и т. д. – метод может потребовать больших временных и физических усилий, при этом высокой степени гомогенности, вероятнее всего, достичь не удастся [13].

В качестве одного из способов решения указанных проблем, сравнительно недавно нашедшего применение при решении химико-аналитических задач, предлагается метод измельчения с твердым диоксидом углерода при помощи куттера. Метод криогомогенизации позволяет получить пробу высокой однородности, с размером частиц от 1 до 56 мкм всего за 5–6 минут [14], при этом масса измельчаемого образца зависит только от размера емкости используемого оборудования.

Еще большие возможности для улучшения показателя повторяемости при анализе образцов открывает применение современного оборудования при проведении разложения образцов. В настоящее время многие лаборатории переходят на использование систем микроволновой пробоподготовки, упростивших классические методы мокрого и сухого озоления [15], использовавшиеся при разложении проб. Микроволновой метод отличается простотой, экспрессностью, отсутствием перекрестной контаминации образцов и большей безопасностью для оператора. Новой ступенью в производстве микроволновых систем стали микроволновые реакторы [16]. Их неоспоримым преимуществом является возможность разложения за один цикл различных матриц разной массы. В таких системах вместо защитных кожухов используется инертный газ, нагнетаемый под высоким давлением в камеру реактора. Благодаря такому решению удается работать с более высокими давлениями и температурой.

Как было указано, для анализа образцов растительной продукции на содержание тяжелых металлов используется метод атомной абсорбции, реализующийся в двух техниках – пламенной и электротермической (ЭТА). Из-за необходимости работать с относительно низкими концентрациями веществ предпочтительнее использовать метод электротермической атомизации как наиболее чувствительный. Однако к недостаткам этого метода можно отнести его высокую стоимость и значительно большее время анализа, по сравнению с методами пламенной ААС. Теоретически снижение пределов обнаружения для пламенной техники возможно за счет использования новых методов детектирования и коррекции фона в современных атомно-абсорбционных спектрометрах высокого разрешения [17, 18]. В таких приборах используется пиксельный полупроводниковый детектор [19], обладающий более высокой чувствительностью по сравнению со стандартными фотоэлектронными умножителями. Преимуществом таких детекторов является возможность регулирования количества пикселей при детектировании: изменяя число оценочных пикселей, возможно влиять на чувствительность метода. Ставший доступным при использовании источников излучения сплошного спектра в сочетании с полупроводниковыми (CCD) детекторами метод коррекции фона по измерению интенсивности поглощения на длинах волн, располагающихся рядом с атомными линиями поглощения, также позволяет снизить пределы обнаружения.

Целью исследования являлась оценка возможности получения достоверных результатов при анализе низких уровней остаточных количеств медьсодержащего пестицида в образцах яблок пламенным атомно-абсорбционным методом при использовании спектрометра высокого разрешения и разработанных подходов к пробоподготовке растительной продукции.

В ходе исследования предполагалось провести предварительную подготовку образцов яблок, включающую гомогенизацию с сухим льдом и последующую минерализацию в микроволновом реакторе и анализ образцов методами электротермической и пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии. Значимость отличий между результатами анализа двумя различными техниками устанавливалась на основании простого теста Стьюдента, а также сравнения характеристик прецизионности, полученных для пламенного и электротермического методов измерения меди в образцах яблок, рассчитанных на основе валидационных тестов.

Материалы и методы. В качестве объектов исследования выступали образцы листьев и плодов яблок, отобранных после обработки препаратом на основе сульфата меди трехосновного.  Обработка яблок проведена в период вегетации в трех различных почвенно-климатических зонах1. Включение в исследование образцов из разных почвенно-климатических зон обусловлено необходимостью учета различий в естественных содержаниях меди в зависимости от типов почв и климатических факторов. Отбор проб осуществлен несколько раз, параллельно отбирались и контрольные образцы [20].

Гомогенизация образцов выполнена с помощью куттера Robot Coupe R10 с емкостью рабочей чаши 11,5 л и скоростью вращения до 3000 об./мин. В чашу загружали всю пробу (масса проб составляла 300 г), туда же помещали сухой лед в соотношении 2 :1 по отношению к объему пробы и измельчали в течение 5 минут. В качестве хладагента используется сухой лед2.

Микроволновая минерализация образцов выполнена при помощи системы микроволнового разложения реакторного типа Milestone ULTRAWave ECR по стандартной программе для разложения фруктов и овощей. В качестве реагента для разложения использовали 5 см3 азотной кислоты. Для приготовления базового раствора для микроволнового реактора использовали 130 см3 деионизированной воды и 5 см3 азотной кислоты высокой степени чистоты. Для получения деионизированной воды I класса чистоты использована система очистки воды проточного типа Milli-Q Integral 5.

Условия минерализации и изменение температуры и давления в ходе процесса представлены на рисунке.

По окончании процесса разложения к образцам добавляли по 1 см3 перекиси водорода, затем штатив с пробирками для разложения помещали на ультразвуковую баню на 15 мин для ускорения процесса дегазации. Прозрачные образцы минерализата переводили в полипропиленовые пробирки на 50 см3 и доводили до метки ультрачистой деионизированной водой.

Условия измерений. При проведении измерений концентрации меди в образцах растительной продукции использован атомно-абсорбционный спектрометр высокого разрешения ContrAA 800 D. В качестве источника внешнего излучения использована ксеноновая короткодуговая лампа сплошного спектра.

Измерения в режиме электротермической атомизации проводились при следующих условиях. Используемая длина волны – 327,3960 нм, учет неселективного поглощения осуществлялся с помощью измерения поглощения на длине волны вблизи атомной линии поглощения. Измерения проводились при использовании 3 оценочных пикселей. Ввод пробы осуществляли автоматически в кювету, объем вводимой пробы – 20 мкл. Температурный режим ЭТА: высушивание – 20 секунд при температуре 80 °С, 20 секунд при температуре 90 °С, 10 секунд при температуре 110 °С, озоление – 20 секунд при температуре 350 °С и 10 секунд при температуре 800 °С, атомизация – 4 секунды при температуре 2150 °С, отжиг – 4 секунды при температуре 2450 °С.

Измерения в режиме пламени проводили на длине волны 324,7540 нм, учет неселективного поглощения осуществлялся с помощью измерения поглощения на длине волны вблизи атомной линии поглощения. Измерения проводились при использовании 7 оценочных пикселей. Ввод пробы осуществляли с помощью пламенного автодозатора. Для атомизации пробы использовалось пламя ацетилен-воздух, при этом объемный расход ацетилена составил 50 дм3/ч, расход окислителя – 75 дм3/ч.

Все необходимые расчеты и статистический анализ проведены с использованием стандартной программы Excel в среде Windows 10 Professional.

Результаты. Итоги оценки значимости различий между результатами измерений концентрации меди сульфата трехосновного в образцах растительной продукции представлены в табл. 1.

Результаты, полученные при валидации пламенного и электротермического методов атомно-абсорбционного определения меди в образцах яблок, представлены в табл. 2.

Обсуждение результатов. Анализируя полученные в процессе статистических расчетов результаты, можно сделать вывод, что значение эмпирически рассчитанного критерия Стьюдента во всех трех почвенно-климатических зонах ниже табличных значений при уровне доверительной вероятности 95 %, что свидетельствует о незначимости различий между результатами измерений, полученных методами пламенной и электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии. Обращает на себя внимание значительный разброс результатов, обуcловленный естественной разницей для различных районов произрастания и различных климатических зон. Однако результат проведения теста однородности дисперсией с помощью критерия Фишера показал, что результаты можно сравнивать (эмпирическое значение критерия Фишера для I почвенно-климатической зоны составило 1,160; II почвенно-климатической зоны – 1,099; III почвенно-климатической зоны – 1,562; табличное значение критерия Фишера при (n–1) = 9; p = 0,95 составляет 3,1).

В процессе валидации получены удовлетворительные значения открываемости и среднеквадратичного отклонения при использовании обоих методов измерений (n = 10).

Установленные результаты позволяют сделать вывод о том, что благодаря применению комбинаций современных методов пробоподготовки и аналитического оборудования метод пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии удается приблизить по метрологическим характеристикам к электротермической атомной абсорбции. Метод криоизмельчения позволяет достичь высокой степени гомогенности растительной пробы любой сложности. Минерализация в микроволновом реакторе позволяет проводить разложение больших навесок, что увеличивает представительность пробы. Относительно недавно популяризированные полупроводниковые детекторы в сочетании с мощным аппаратом коррекции фона в современных атомно-абсорбционных спектрометрах позволяют значительно повысить чувствительность измерений.

Обработка медьсодержащими препаратами может приводить не только к накоплению, как ожидается, в первые дни после обработки, но и к снижению содержания меди к концу вегетационного периода в обработанных растениях по сравнению с необработанными. Подобная ситуация неоднократно наблюдалась при изучении динамики разложения и накопления пестицидов на основе меди в пищевых продуктах различных районов произрастания3 [21].

Данные, полученные в натурных условиях, показывают, что уровни естественного содержания меди в растительных объектах значительно разнятся и зависят от множества факторов – района произрастания, сорта растений, погодных условий в период вегетации, что отражается в накоплении микроэлементов, и других.

Данный фактор имеет особое значение и требует высокой точности определения при оценке накопления внесенных количеств действующих веществ на основе меди на фоне естественного содержания анализируемого элемента в объекте исследования.

Заключение. Опираясь на полученные результаты, можно сделать вывод, что применение комбинации современных методов пробоподготовки в сочетании с высокочувствительным оборудованием с новыми методами коррекции фонового поглощения и современным детектированием позволяет значительно снизить предел обнаружения и разброс даже при использовании менее чувствительной, однако более доступной техники пламенного атомно абсорбционного анализа.

Криоизмельчение сокращает временные затраты на гомогенизацию одной пробы с нескольких суток до нескольких минут. Микроволновые реакторы позволяют разлагать до 20 проб одновременно, при этом нет необходимости разделять циклы разложения проб с различными матрицами. Пламенная техника атомизации позволяет понизить стоимость анализа и значительно увеличить производительность.

Повышение достоверности химико-аналитического определения медьсодержащих пестицидов имеет значительный интерес при гигиенических исследованиях, в частности при заключении о присутствии элемента, обусловленном обработкой препаратом, а также при разработке эффективных процедур защиты растений.

1. Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности. = Утв. научно-техническим советом (секция земледелия и растениеводства) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (протокол № 15 от 16.11.2018). М.: Минсельхоз России, 2018. URL: https://mcx.gov.ru/upload/iblock/9a8/9a8fd716c8005c1d266df1e7908ed222.pdf 2. ГОСТ 12162–77 «Двуокись углерода твердая. Технические условия». М.: Издательство стандартов, 1995. URL: https://docs.cntd.ru/document/1200018944 3. EPA Guidelines for Responsible Pesticide Use. URL: https://www.epa.sa.gov.au/files/477372_guide_pesticides.pdf (дата обращения 21.04.2021).