Введение. Использование антибиотиков в медицине и ветеринарии привело к их накоплению в природной среде (водоемах, в том числе питьевого назначения, почве, донных отложениях), что явилось одной из причин формирования устойчивости отдельных видов бактерий к действию антимикробных препаратов [1–5]. Важную роль в процессах распространения и сохранения устойчивых патогенов играют природные водные экосистемы, которые служат резервуаром для развития резистентности [6][7]. Устойчивость микроорганизмов к противомикробным препаратам ограничивает перечень антибиотиков для лечения инфекционных заболеваний человека, увеличивает риск развития тяжелых осложнений и распространения инфекций, наносит вред здоровью животных и окружающей среде [8]. Контроль содержания антибактериальных препаратов в питьевой воде и воде водных объектов имеет большое значение для изучения развития и распространения антибиотикорезистентности у возбудителей заболеваний. В рамках реализации Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года1 разработаны и внедрены гигиенические нормативы содержания 18 антибактериальных препаратов в водных средах, в том числе в питьевой воде различных источников водоснабжения2 . В настоящее время отечественные методики определения антибиотиков в воде с учетом вновь разработанных гигиенических нормативов в методической базе Российской Федерации отсутствуют.

Исследования содержания антибиотиков в водных средах, проводимые во многих странах мира, выявили присутствие широкого спектра антибиотиков в природных и сточных водах в следовых концентрациях в диапазоне от нг/дм³ до мкг/дм³ [9]. Максимальные концентрации антибиотиков обнаружены в сточных водах фармацевтических предприятий, медицинских учреждений и животноводческих ферм, которые являются основным источником загрязнения природных вод [10]. Приводятся данные об обнаружении антибиотиков в питьевой воде [11].

Определение при совместном присутствии в воде антибиотиков, относящихся к различным структурным группам и обладающих разными физико-химическими свойствами, остается сложной задачей. Для анализа остаточных количеств антибиотиков в водных средах, включая питьевую воду, необходимы высокочувствительные и селективные методики. В настоящее время перспективным методом анализа низких концентраций антибиотиков в водных средах, продуктах питания, почве и других объектах является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ/МС-МС) из-за высокой чувствительности и высокой селективности детектора [12]. Особое внимание при разработке методик количественного анализа антибиотиков в водных средах уделяется отработке условий извлечения аналитов из матрицы. Одним из эффективных и простых в техническом плане способов извлечения целевых компонентов из водных сред является твердофазная экстракция (ТФЭ), включающая селективное извлечение, очистку экстракта при необходимости и концентрирование пробы за одну процедуру [13–15]. Для эффективного извлечения антибиотиков из водных сред методом ТФЭ успешно применяются картриджи Oasis HLB, способные удерживать широкий спектр полярных и неполярных молекул с кислотными, нейтральными и основными свойствами [11][16–19].

Цель исследования: разработка методики определения антибиотиков классов макролидов, пенициллинов и фторхинолонов в воде на уровне гигиенических нормативов методом ВЭЖХ/МС-МС.

Материалы и методы. Исследования по разработке методики определения 8 антибиотиков (азитромицина, амоксициллина, ампициллина, бензилпенициллина, кларитромицина, оксациллина, ципрофлоксацина и эритромицина) в воде проведены в период 2022–2023 гг. на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором LCMS-8050 с тройным квадруполем (Shimadzu, Япония). Стандартные растворы антибиотиков для построения градуировочных кривых готовили растворением аналитических стандартов с массовой долей основного вещества 93,8–99,5 % (производство Merck, EDQM, Dr. Ehrenstorfer Reference Materials) в метаноле с последующим разбавлением деионизированной водой до нужной концентрации.

Масс-спектрометрическое детектирование проводили с использованием электроспрея в режиме генерации положительно заряженных ионов. Параметры масс-спектрометрического детектора LC/MS 8050, отвечающие за поступление целевых компонентов из жидкостного хроматографа в масс-спектрометрический детектор, представлены в табл. 1.

Определение родительских и дочерних ионов антибиотиков проводили с использованием программного обеспечения LabSolution (Shimadzu, Япония) в автоматическом режиме, анализируя стандартные растворы исследуемых соединений с концентрациями 100 нг/см³. Тип сканирования – мониторинг множественных реакций (MRM). В качестве основных дочерних ионов для каждого антибиотика выбирали дочерний ион, имеющий максимальный отклик сигнала детектора. Остальные дочерние ионы, полученные при фрагментации индивидуального антибиотика, отнесены к подтверждающим дочерним ионам.

Изучение эффективности хроматографического разделения 8 антибиотиков проводили на колонке с обращенно-фазным сорбентом ZORBAX Eclipse XDB-C18 длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм зернением 3,5 мкм (Agilent Technologies, США) с использованием стандартных растворов изучаемых соединений в метаноле с концентрациями 100 нг/см³. Экспериментально подбирали количественный состав подвижной фазы, состоящий из смеси метанола и деионизированной воды с добавлением в качестве модификатора муравьиной кислоты с концентрацией 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 %, и режим градиентного элюирования. Для оценки хроматографического разделения антибиотиков рассчитывали коэффициент селективности α (фактор разделения) и разрешение пиков R (степень разделения)3. Разделение считается полным при условии α ≥ 1,0; R ≥ 1,0.

Отработку условий извлечения антибиотиков способом твердофазной экстракции (ТФЭ) проводили на образцах питьевой воды централизованного водоснабжения, природной воды поверхностных и подземных источников и воды бассейнов. Изучали эффективность применения картриджей Oasis HLB (сорбционная емкость 60, 200 и 500 мг) и картриджей Strata C18-E (сорбционная емкость 500 мг). Перед проведением процедуры ТФЭ картриджи кондиционировали, последовательно пропуская через них 5 см³ органического растворителя и 5 см³ деионизированной воды. Пропускали через подготовленные картриджи водные стандартные растворы объемом 10–100 см³ с известной концентрацией антибиотиков самотеком, без применения вакуума, промывали 2 см³ деионизированной воды и элюировали с картриджа различными объемами ацетонитрила или метанола в условиях кислой и нейтральной среды. Полученный экстракт концентрировали в 10–50 раз в токе воздуха и анализировали методом ВЭЖХ/МС-МС. Наличие «проскока» при проведении ТФЭ устанавливали путем анализа целевых компонентов в сливах после нанесения стандартных образцов на картриджи и промывки сорбента после нанесения образцов. Степень экстракции (R) рассчитывали по формуле4:

,

где

R – степень экстракции вещества, %;

А – количество вещества, извлеченное органическим растворителем;

N – заданное количество вещества в водном образце.

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость сигнала детектора от массовой концентрации основного дочернего иона антибиотика в анализируемом растворе устанавливали методом абсолютной градуировки с проведением твердофазной экстракции перед хроматографическим анализом за исключением бензилпенициллина, оксациллина, ампициллина (по причине высоких ПДК анализ данных веществ не требовал концентрирования и дополнительных этапов пробоподготовки). Диапазон измеряемых концентраций антибиотиков в водных средах подбирали с учетом предельно допустимых концентраций и ориентировочных допустимых уровней в соответствии с СанПиН 1.2.3685–21 (табл. 5) с кратностью от 0,25 до 2,5 относительно гигиенического норматива.

Исследования по оценке погрешности выполнения измерений концентраций антибиотиков в воде проводили методом «задано – получено» с использованием в качестве матриц питьевой воды централизованного водоснабжения, природной родниковой воды и воды бассейна. На основании экспериментальных данных рассчитывали метрологические показатели методики определения массовых концентраций 8 антибиотиков в водных средах методом ВЭЖХ/МС-МС, характеризующие степень достоверности результатов измерений.

Апробацию методики проводили на образцах водопроводной воды систем централизованного водоснабжения, природной воды и воды плавательных бассейнов, отобранных в осенний период 2023 г.

Результаты. Проведена оптимизация параметров масс-спектрометрического детектора в режиме мониторинга множественных реакций (МРМ) для идентификации антибиотиков, в результате которой зарегистрированы родительские и дочерние ионы в условиях оптимального соотношения между напряжением фрагментора и энергией ячейки соударения (табл. 2). В качестве основного дочернего иона для каждого антибиотика выбран ион, имеющий максимальный отклик сигнала детектора (100 %) (табл. 2), который использовался для количественного расчета. Остальные дочерние ионы, полученные при фрагментации индивидуальных соединений, отнесены к подтверждающим дочерним ионам.

Изучение условий хроматографического разделения 8 антибиотиков показало качественное разделение амоксициллина, ципрофлоксацина ампициллина, азитромицина на колонке ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2,1 × 150 мм) зернением 3,5 мкм в условиях градиентной подачи подвижной фазы, состоящей из смеси метанола и 0,1 % раствора муравьиной кислоты в деионизированной воде со скоростью 0,3 см³/мин (табл. 3). Идентификацию эритромицина, бензилпенициллина, оксациллина и кларитромицина проводили по наличию на хроматограмме характерных родительского и дочерних ионов.

Значения параметров хроматографического разделения изучаемых антибиотиков в подобранных условиях анализа представлены в табл. 4. Коэффициенты селективности (α) составили 1,0–1,2, значения коэффициентов разрешения пиков (R) – больше 1, за исключением бензилпенициллина и кларитромицина.

Хроматограмма стандартной смеси азитромицина, амоксициллина, ампициллина, бензилпенициллина, кларитромицина, оксациллина, ципрофлоксацина и эритромицина в метаноле с концентрациями 100 нг/см³ представлена на рис. 1.

Изучение эффективности извлечения антибиотиков из водных сред способом твердофазной экстракции показало, что применение классического обращенно-фазного сорбента С18 на основе силикагеля (Strata C18-E) не позволило добиться удерживания амоксициллина на картридже Strata, при нанесении стандартного образца объемом 10 см³ потери аналита составили 45 %.

При отработке условий проведения твердофазной экстракции с использованием картриджей Oasis HLB установлено, что использование патронов с сорбционной емкостью 60 мг (Oasis HLB 3СС/60 мг) приводит к большим потерям амоксициллина (до 85 %) и ампициллина (до 25 %) на этапе нанесения пробы объемом 10 см³ на картридж. Отсутствие «проскоков» аналитов наблюдалось на картриджах с большей сорбционной емкостью – Oasis HLB 6СС/500 мг при загрузке стандартных водных растворов антибиотиков объемом 10 см³ без применения вакуума или избыточного давления. Данный объем пробы достаточен для анализа изучаемых соединений с чувствительностью на уровне 0,25–2,5 гигиенических нормативов и нижним пределом определения изучаемых антибиотиков в воде 5–20 нг/дм³ с учетом концентрирования полученных экстрактов в 50–10 раз. Увеличение объема пробы до 100 см³ приводило к существенному повышению потери аналитов на этапе нанесения пробы на картридж. Экспериментально установлено, что для ципрофлоксацина потери составляли до 90 %, азитромицина – до 10 %.

В зависимости от различных кислотно-основных свойств изучаемых аналитов, величин ПДК, отличающихся более чем в 1000 раз, и чувствительности детектора отработаны два варианта подготовки проб воды к анализу с использованием картриджей Oasis HLB 6СС/500 мг – в условиях кислой и нейтральной среды. Вариант 1 – для извлечения эритромицина из водных сред предварительно промывали картридж 5 см³ метанола и 5 см³ деионизированной воды, загружали на картридж 10 см³ пробы воды, промывали 2 см³ деионизированной воды и элюировали эритромицин 10 см³ метанола. Для достижения необходимой чувствительности полученный экстракт концентрировали в 10 раз при плюс 40 °С в токе воздуха, фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм и анализировали в подобранных хроматографических условиях. Вариант 2 – твердофазную экстракцию азитромицина, амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина из проб воды проводили, предварительно пропуская через картридж 5 см³ 0,1 % раствора муравьиной кислоты в метаноле, 5 см³ деионизированной воды, загружали на картридж 10 см³ пробы воды, промывали 2 см³ деионизированной воды и элюировали целевые компоненты 5 см³ 0,1 % раствора муравьиной кислоты в метаноле. Полученный экстракт концентрировали в 50 раз при плюс 40 °С в токе воздуха, фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм и анализировали в подобранных хроматографических условиях. Время проведения ТФЭ одной пробы не превышает 15 минут, при использовании устройства для твердофазной экстракции в течение 15 минут можно провести одновременную экстракцию до 10 проб.

Исследование возможности применения процедуры высушивания экстракта досуха после ТФЭ показало, что в случае изучаемых антибиотиков (азитромицина, амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина) недопустимо полное упаривание экстракта из-за больших потерь целевых соединений. В ходе экспериментов установлено, что при полном высушивании экстрактов при комнатной температуре потеря ципрофлоксацина и эритромицина достигала 25 %, азитромицина и амоксициллина – 10 %. С целью снижения потери анализируемых соединений при высушивании экстракта в токе воздуха на первом этапе упаривали пробу до 1 см³, к концентрату добавляли 0,1 см³ деионизированной воды, перемешивали и затем упаривали пробу до объема 0,2 см³. Проведение ТФЭ в приведенных условиях обеспечивает извлечение ципрофлоксацина на уровне 73 %, кларитромицина – 100 %, азитромицина – 72 %, амоксициллина – 89 %, эритромицина – 100 %. Определение антибиотиков пенициллинов (ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина) проводили без концентрирования проб, так как чувствительность масс-спектрометрического детектора при прямом вводе проб воды достаточна для их определения на уровне 0,25–2,5 ПДК. Анализируемые пробы воды предварительно фильтровали через целлюлозно-ацетатный фильтр с размером пор 0,2 мкм, отбрасывая первые 5 см³ фильтрата, и анализировали в подобранных хроматографических условиях.

Градуировочные зависимости y = ax + b для определения антибиотиков в анализируемом растворе представлены на рис. 2.

Градуировочные коэффициенты (К) для измерения массовых концентраций антибиотиков в водных средах составили 1,7 × 10–7 … 4,7 × 10–5. Достоверность аппроксимаций (R²) варьировала в пределах 0,9612–0,9937, погрешность построения градуировочных зависимостей составила от 11,5 % для ампициллина до 14,5 % для ципрофлоксацина. Нижний предел обнаружения (НПО) антибиотиков составил 5–20 нг/дм³. Диапазоны измеряемых концентраций в воде, гигиенические нормативы содержания и класс опасности изучаемых антибиотиков представлены в табл. 5. В заданных диапазонах измерений сохраняется линейность зависимости сигнала масс-спектрометрического детектора от концентрации основного дочернего иона определяемого антибиотика в анализируемом растворе.

Проведена метрологическая аттестация методики выполнения измерений массовых концентраций азитромицина, амоксициллина, ампициллина, бензилпенициллина, кларитромицина, оксациллина, ципрофлоксацина и эритромицина в воде методом ВЭЖХ/МС-МС. Показатель точности (границы относительной погрешности при доверительной вероятности Р = 0,95) определения азитромицина в воде составляет 34 %, амоксициллина – 32 %, кларитромицина – 29 %, ципрофлоксацина – 33 %, оксациллина – 24 %, бензилпенициллина – 20 %, ампициллина – 22 %, эритромицина – 24 %. Показатели повторяемости и воспроизводимости определены в диапазонах 6–14 и 7–16 % соответственно.

Проведены исследования содержания антибиотиков в образцах воды, отобранных в летний период на территории крупного промышленного центра: точка 1 – вода питьевая централизованного водоснабжения, точка 2 – ключевая вода в черте города, точка 3 – вода плавательного бассейна, точка 4 – ручей, расположенный рядом с лечебным учреждением (стационар), точка 5 – речная вода, точка 6 – речная вода в точке сброса очищенных бытовых сточных вод. Анализ проводился в день отбора проб на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором с тройным квадруполем LSMS 8050 (Shimadzu). В результате анализа отобранных образцов воды не обнаружено содержание антибиотиков ни в одной пробе на

уровне выше НПО, равного 0,25 ПДК для каждого изучаемого антибиотика. Отрицательные результаты содержания антибиотиков в пробах воды, возможно, связаны с процессами фотодеградации, сорбцией донными отложениями, протекающими в водоемах, или отсутствием источников выделения изучаемых антибиотиков на территории обследования.

Обсуждение. Рассмотрены методические подходы к разработке методики количественного определения антибиотиков групп пенициллинов, макролидов и хинолонов в воде методом ВЭЖХ/МС-МС с применением твердофазной экстракции в качестве пробоподготовки. Полученные результаты согласуются с данными научно-технической и методической литературы [20–26].

Применение метода тандемной хромато- масс-спектрометрии обеспечило возможность селективного обнаружения антибиотиков по характерным масс-спектрам родительских и дочерних (основных и подтверждающих) ионов, установленные значения которых соответствуют опубликованным данным [20].

Примененный метод ТФЭ для подготовки образцов воды к анализу показал высокую степень извлечения изучаемых антибиотиков. Так, степень экстракции эритромицина на липофильно-гидрофильном картридже Oasis HLB в отработанных нами условиях составляет 100 %, амоксициллина – 89 %, в то время как экстракция на обращенно-фазовом картридже Strata X из проб большего объема не превышает 37,2 % [21] и 33 % [22] соответственно. Степень экстракции остальных антибиотиков установлена на уровне 72–100 %.

Нижние пределы определения (НПО) антибиотиков в образцах воды объемом 10 см³ составили 5–20 нг/дм³. Низкие значения НПО сопоставимы с результатами хромато-масс-спектрометрических исследований тех же классов антибиотиков с концентрированием на картриджах Oasis HLB в образцах воды большего объема от 500 см³ [18][23] до 1000 см³ 5 [24][25]. Повышение чувствительности определения антибиотиков на фоне анализа небольшого объема образца, возможно, связано со снижением влияния матричного эффекта, зависимого в том числе от кратности концентрирования анализируемой пробы воды.

Погрешность количественного определения антибиотиков в воде методом абсолютной градуировки с проведением процедуры ТФЭ составила 24–34 %, при прямом вводе проб – 20–24 %. Значения погрешности и ее составляющих сопоставимы с уровнями погрешностей, полученными при использовании метода внутреннего стандарта для построения градуировочной характеристики и количественного хромато-масс-спектрометрического анализа антибиотиков классов макролидов, пенициллинов и фторхинолонов в водных средах [26].

Преимущество разработанной методики заключается в существенном сокращении времени подготовки проб и в целом продолжительности одного анализа, не превышающей 30 мин.

Апробация методики проведена при исследовании проб воды источников централизованного водоснабжения, природной воды и воды плавательных бассейнов. Результаты исследований показали отсутствие изучаемых антибиотиков в проанализированных пробах в концентрациях на уровне и выше 0,25 ПДК и 0,25 ОДУ, что, вероятно, может быть связано с отсутствием источников выделения изучаемых антибиотиков на территории обследования или другими, не изученными в настоящей работе факторами.

Ограничения исследования. Связаны с ограниченным по времени периодом отбора и недостаточным количеством проанализированных проб воды. Расширение перечня обследуемых водоемов на различных территориях может стать направлением дальнейших исследований по оценке содержания антибиотиков в водных средах.

Заключение. Разработанная методика может быть использована в гигиенических исследованиях содержания остаточных количеств антибиотиков в воде для оценки качества источников питьевого и культурно-бытового водоснабжения.

1. Распоряжение Правительства РФ «О Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в РФ на период до 2030 г.». Утверждено распоряжением Правительства Российской Федерации от 25 сентября 2017 г. № 2045-р https://www. garant.ru/products/ipo/prime/doc/71677266 2. СанПиН 1.2.3685–21 «Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания». Утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28 января 2021 года № 2. 3. Пругло Г.Ф., Федорова О.В., Смит Р.А. Хроматографические методы анализа: учебное пособие. СПб.: ВШТЭ СПбГУПТД, 2017. 85 с. 4. Токсикологическая химия: учебник / Т. Байзолданов. – Алматы: Эверо, 2021. 240 с. 5. EPA Method 1694: Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water, Soil, Sediment, and Biosolids by HPLC/MS/MS. 2007.