Введение. Токсигенные штаммы Vibrio cholerae О1 (классического и Эль Тор биоваров) и О139 серогрупп вызывают острую инфекционную болезнь – холеру. Пандемии этой болезни преследуют человечество уже более двух столетий. Начиная с 1961 года и до сих пор продолжается 7-я пандемия, вызванная токсигенными типичными штаммами V. cholerae О1 биовара Эль Тор. В 90-х годах прошлого столетия типичные Эль Тор вибрионы были вытеснены более вирулентными генетически измененными штаммами V. cholerae О1 биовара Эль Тор (геновариантами). Геноварианты содержат аллели гена B-субъединицы холерного токсина ctxB1 или ctxB7 и отличаются от типичных штаммов не только повышенной вирулентностью, но и высоким адаптационным потенциалом и множественной устойчивостью к антибиотикам. Геном геновариантов продолжает изменяться, появляются замены, вставки, делеции в генах вирулентности, пандемичности, адаптации [1][2]. Показано, что важная роль в генетическом разнообразии штаммов V. cholerae, а также эволюции патогена принадлежит холерным бактериофагам (фагам). Считается, что ряд мобильных генетических элементов (МГЭ) (профаг СТХφ, RS1φ, TLC элемент, гены системы секреции 6-го типа), непосредственно связанные с проявлением вирулентных свойств, имеют фаговое происхождение [3][4].

Холерные литические фаги распространены очень широко. Их обнаруживают в водной среде, а также вместе с вибрионами в стуле больных холерой. Высказывается предположение, что холерные фаги действуют как фактор, ослабляющий сезонные вспышки холеры [5][6]. Установлено, что возникающие в результате фаговой инфекции устойчивые изоляты лучше выживают во внешней среде по сравнению с чувствительными штаммами [4]. Однако у них могут изменяться вирулентные свойства, в том числе снижаться способность к колонизации, так как одним из механизмов фагоустойчивости является изменение структуры рецепторов, в качестве которых часто выступают белки внешней мембраны, О1 антиген, выполняющие роль адгезинов [2]. Стоит отметить, что холерные фаги широко используются в практической работе, их применяют для типирования и определения биовара вновь выделяемых штаммов V. cholerae О1 серогруппы [7]. Для дифференциации биоваров применяют два фага – классический и эльтор1. Однако в последние годы все чаще выделяются штаммы V. cholerae О1 биовара Эль Тор (особенно из внешней среды), устойчивые к литическому действию фага эльтор, что затрудняет его использование в диагностических целях и диктует необходимость поиска новых фагов [8][9]. Необходимо также отметить, что в связи с появлением штаммов V. cholerae с множественной устойчивостью к антибиотикам активно развивается направление по использованию фагов в лечебных и профилактических целях [2][10–12]. Однако для получения эффекта при использовании фаговых препаратов, а также с целью выявления механизмов появления фагоустойчивых изолятов необходимо исследовать присутствие и структуру антифаговых систем в штаммах V. cholerae.

Для защиты от фагов V. cholerae выработал различные способы сопротивления [7][11][13]. Так недавно обнаруженные фагоиндуцируемые PLE (Phage-inducible Chromosomal Island-like Elements) острова способствуют устойчивости патогена к действию фага ICP1, являющегося самым распространенным литическим фагом на территории эндемичных стран [13]. PLE острова, расположенные на второй хромосоме (большинство входит в состав суперинтегрона), включают около 26 открытых рамок считывая, большинство из которых кодирует белки с неизвестной функцией. В настоящее время выявлено 10 типов PLE островов. Установлено, что каждый тип присутствовал в штаммах V. cholerae, циркулировавших в определенное время. Показано, что при контакте клеток с фагом ICP1 происходит образование репликативных форм PLE элемента и последующее образование фаговых частиц, несущих генетический PLE материал. Зараженные фагом клетки в итоге лизируются, но предотвращается заражение других бактерий, что способствует сохранению популяции [13][14]. В ранее проведенных работах показано, что в токсигенных штаммах V. cholerae О1 биовара Эль Тор, завезенных на территорию РФ и сопредельных стран, присутствует остров PLE4 (таблица) [14][15].

В хромосоме ряда штаммов возбудителя холеры обнаружено присутствие еще одного МГЭ с антифаговыми генами – острова GI, включающего геном умеренного каппа фага (или фага Карра) [16–18].

Одна из главных функций данного фага – защита патогена от действия других фагов (в результате его внедрения изменяется структура рецепторов). Стоит отметить, что присутствие каппа фага влияет на экспрессию резидентных генов бактерии-хозяина, а также способствует появлению изолятов, устойчивых к действию неблагоприятных факторов внешней среды [16].

Недавно было установлено, что антифаговые гены входят в состав МГЭ V. cholerae, ранее не рассматриваемых как связанных с фаговой защитой. В том числе они обнаружены в ICE SXT элементах, участвующих в распространении генов, кодирующих множественную устойчивость к антибиотикам [19]. ICE SXT элементы имеют мозаичную структуру, состоят из основных генов (52), необходимых для их интеграции/ исключения, регуляции, передачи при коньюгативном переносе, и дополнительных, которые расположены в вариабельных регионах (VR1-VR3) и «горячих точках» (hotspot) интеграции (HS1-HS5). Гены, обеспечивающие устойчивость патогена одновременно к нескольким антибиотикам, находятся в VR3 и HS3. Гены, обеспечивающие резистентность к фагам, сгруппированы в HS5. Выявлено, что при делеции генов HS5 штаммы становятся чувствительными к фагам. Также показано, что эволюция ICE SXT элементов в различных штаммах V. cholerae происходит в результате генетического обмена между этими вариабельными участками [19][20]. Анализ структуры HS5 выявил, что во всех типах ICE SXT присутствует ген orf1, кодирующий регуляторный белок с WYL-доменом, предположительно выполняющего роль репрессора; гены, кодирующие белки с неустановленной функцией, а также одна или две системы защиты от фагов. Так, в HS5 ICEVchInd6 обнаружены системы рестрикции-модификации I и IV типов, продукты которых фрагментируют ДНК фага при его попадании в клетки. В ICE VchInd4 (также известным как ICE VchBan11), ICE VchInd5 и ICE VchBan9 (или ICE VchMoz10) присутствует BREX (bacteriophage exclusion) система, структура и состав генов которой уникален для каждого типа ICE SXT элемента. Гены BREX системы кодируют белки, уничтожающие фаги по невыясненному пока механизму. В HS5 ICE VchInd5 и ICE VchInd4 кроме BREX дополнительно присутствует ген abi (abortive infection), кодирующий белок, ускоряющий лизис зараженных фагом клеток. Таким образом, присутствие ICE SXT элемента способствует устойчивости штаммов одновременно к антибиотикам и фагам [19]. Наличие генов антибиотикорезистентности, расположенных на ICE SXT элементе, в штаммах V. cholerae О1 Эль Тор биовара, завезенных на территорию РФ и некоторых сопредельных стран, изучено ранее другими исследователями [16][17][21]. В то же время структура HS5 в данных штаммах, а также присутствие каппа фага исследованы не в полной мере [16][17][19].

Цель исследования – выявление антифаговых сис тем, расположенных на мобильных генетических элементах, в штаммах V. cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор.

Материалы и методы. В работе использовали нуклеотидные последовательности полных геномов 77 токсигенных штаммов V. cholerae О1 биовара Эль Тор, завезенных с 1970 по 2014 г. на территорию РФ и сопредельных стран, полученные в ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» или представленные в свободном доступе в NCBI GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) (таблица).

Генетическая структура ряда использованных в работе штаммов, в том числе аллель гена ctxB, была установлена ранее другими исследователями [16][17][22][23]. Для выявления каппа фага и антифаговых систем в ICE SXT элементах применяли алгоритм Blast NCBI GenBank (http://blast.ncbi) и программу BioEdit V.7. В качестве референсных использовали штаммы V. cholerae и нуклеотидные последовательности, приведенные в работе [19]. Филогенетический анализ проводили с использованием сервера REALPHY (Reference sequence Alignment-based Phylogeny builder), в котором нуклеотидные последовательности геномов (или фрагментов) изучаемых штаммов сравниваются с наиболее близкими аналогами (дивергенция < 5 %), представленными в NCBI GenBank, что позволяет получить точные данные по филогении (http://realphy.unibas.ch) [24]. Визуализацию результатов проводили с помощью программы FigTree v1.4. Вывод о наличии связи между присутствием в геноме двух различных МГЭ подтверждали с помощью chi-square test (при α = 0,05, df = 1) в программе Rstudio.

Результаты. На первом этапе работы у взятых в анализ штаммов V. cholerae О1 серогруппы Эль Тор исследовали присутствие умеренного каппа фага. В результате установлено, что, за исключением штамма V. cholerae С-347, у остальных типичных штаммов данный фаг отсутствует. В то же время его наличие установлено в геноме 34 генетически измененных штаммов (57 % от изученных). При этом выявлена прямая связь между присутствием каппа фага и островом PLE4 (таблица).

На следующем этапе работы был проведен анализ антифаговых генов HS5 ICE SXT элементов. Предварительно у взятых в исследование штаммов V. cholerae О1 биовара Эль Тор было изучено наличие ICE SXT элементов с использованием ранее рассчитанных праймеры [25]. В результате установлено, что, за исключением типичных штаммов V. cholerae О1 Эль Тор, остальные содержали данный мобильный элемент (таблица), что подтверждает ранее полученные сведения об отсутствии ICE SXT элемента в штаммах V. cholerae О1 Эль Тор биовара, завезенных в 1970–1991 гг. [16][21][26]. В ранее проведенной работе у некоторых штаммов, завезенных в РФ и сопредельные страны, был установлен тип антифаговых систем в HS5 [19]. Мы продолжили исследования и выявили, что геноварианты V. cholerae О1 Эль Тор, занесенные в последние годы и имеющие аллель ctxB7, включают BREX систему с геном abi, что характерно для ICE VchInd5. В то же время у геновариантов с аллелем ctxB1 присутствует как BREX с abi, так и BREX, типичная для ICE VchBan9 (таблица).

Необходимо отметить, что PLE4 присутствует только в штаммах V. cholerae О1 Эль Тор, содержащих ICE SXT ICE VchBan9. Исключение составил штамм V. cholerae 89, включающий ICE VchBan9, но не имеющий PLE4 (таблица). Учитывая, что указанный штамм изолирован из внешней среды [21], можно высказать предположение, что PLE4 был утерян при нахождении штамма в водной среде.

Таким образом, все изученные геноварианты V. cholerae О1 Эль Тор биовара, завезенные на территорию РФ и сопредельных стран, содержат в составе HS5 три вида антифаговых систем – BREX, характерную для ICE VchBan9, BREX с геном abi, специфичные для ICE VchInd5 и систему DISARM, характерную для ICE VchCHN956.

На заключительном этапе для выявления эволюционных взаимоотношений между изученными штаммами был проведен филогенетический анализ. В работу не были взяты типичные штаммы, так как в ранее проведенных работах уже было показано, что они формируют отдельную группу [21, 26]. В итоге установлено, что все изученные геноварианты четко разделились на три кластера.

В первый (I) вошли 5 изолятов, завезенных в 1999 году в Южно-Сахалинск и Владивосток, имеющих ICE VchCHN956 с DISARM системой и не содержащих PLE островов. В геноме трех штаммов выявлено присутствие каппа фага (таблица). Вторую группу (II) составили штаммы с ICE VchInd5, лишенные PLE4 и каппа фага. Отдельную подгруппу в данном кластере образовали геноварианты с аллелем ctxB7, завезенные в последние годы. Третья клада (III) включала штаммы с PLE4 и ICE VchBan9, среди которых большинство имели каппа фаг. Стоит отметить, что в данную группу вошли штаммы, вызвавшие вспышку холеры в Дагестане в 1994 году, которые распределились по разным подгруппам, что соответствует ранее полученным данным [16]. Таким образом, можно высказать предположение, что особое сочетание антифаговых систем на определенном этапе эволюции возбудителя холеры способствует появлению эпидемически значимых штаммов, которые становятся доминирующими, но в последствие они могут заменяться изолятами с другой структурой антифаговых генов.

Обсуждение. При исследовании антифаговых систем в ICE SXT установлено, что изученные штаммы содержат в HS5 три вида антифаговых систем – BREX, характерную для ICE VchBan9, и BREX с геном abi, входящих в состав ICE VchInd5, а также систему DISARM, ассоциированную с ICE VchCHN956. Установленные на основе изучения структуры HS5 типы ICE SXT элемента у ряда штаммов V. cholerae О1 Эль Тор совпали со сведениями других авторов, полученными при анализе генов антибиотикорезистентности [21][26]. Выявленные нами данные указывают на возможность определения типа ICE SXT элемента на основе изучения структуры HS5. Стоит отметить, что среди исследованных штаммов геновариантов отсутствуют изоляты, лишенные HS5, которые встречаются на эндемичной территории. Также на территорию нашей страны и в сопредельные государства не завозились штаммы, имеющие ICE VchInd5 с делецией (около 17 т.п.н.), затрагивающей большую часть HS5 (с сохранением только генов brxL, orf8 и abi). Ранее данные изоляты были обнаружены в Непале (2010), Мексике (2013), Республике Гаити (2012–2017 гг.) [19].

Показано, что 88 % штаммов геновариантов (30 штаммов), имеющих антифаговый остров PLE4, содержат также каппа фаг (таблица). Присутствие нескольких МГЭ с антифаговыми системами (PLE4, каппа фаг, ICE VchBan9) в ряде изученных штаммов может указывать на их существование в условиях активного воздействия литических фагов.

Установлено, что штаммы с PLE4 и ICE VchBan9, большинство из которых содержит также каппа фаг, независимо от места и года выделения группируются в филогенетически отдельный кластер. Штаммы с ICE VchInd5, лишенные PLE4 и каппа фага, также формируют свою обособленную группу. Полученные нами данные подтверждают сведения 4Angermeyer и соавт., также показавших корреляцию присутствия определенного вида PLE островов с типом ICE SXT элементов при филогенетическом анализе штаммов V. cholerae О1 биовара Эль Тор, выделенных в Бангладеш в 2016–2019 гг. [14]. В заключение можно сделать вывод об очевидной связи между различными структурами, участвующими в процессе реализации устойчивости к фагам. Имея фундаментально общую цель – защитить клетку от негативного влияния фагов, эти системы, вероятно, развивались связанно, что выражается в формировании отдельных групп штаммов с определенными сочетаниями этих элементов. Благодаря этому анализ антифаговых генов позволяет выявлять генетические различия между штаммами холерного вибриона, имеющими одинаковый набор генов устойчивости к антибиотикам [19]. Так, например, в ранее проведенном исследовании показано, что клинические штаммы V. cholerae I-1298 и I-1300 (Южно-Сахалинск, 1999) имеют одинаковую структуру генов вирулентности и содержат идентичный состав генов антибиотикорезистентности [17]. Однако указанные штаммы отличаются как по содержанию PLE4, так и по структуре HS5 ICE SXT элемента (таблица). В штамме V. cholerae I-1298 присутствует PLE4, а в HS5 содержатся гены BREX системы, характерные для ICE VchBan9. В то же время у V. cholerae I-1300 остров PLE4 отсутствует, а в HS5 выявлена DISARM (Defence Island System Assisted with Restriction Modification) система с рестрикционно-модификационными генами, ранее обнаруженная в штаммах V. cholerae, циркулирующих в Китае [14][19]. На основе выявленных различий можно высказать предположение, что данные штаммы не являются родственными.

Таким образом, не вызывает сомнений важность изучения механизмов антифаговой защиты штаммов V. cholerae О1 биовара Эль Тор, которое может помочь в понимании эволюции возбудителя, его адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды, определении связи между разными группами штаммов, а также разработке альтернативных методов борьбы с данной бактериальной инфекцией.

Заключение. Получены данные о присутствии систем защиты от фагов в геноме ранее завезенных на территорию РФ и сопредельных стран токсигенных штаммов V. cholerae О1 биовара Эль Тор, что расширяет сведения об их генетической организации. Учитывая активное развитие направления по использованию фагов в качестве лечебных и профилактических препаратов, понимание механизмов взаимной адаптации между возбудителем и высокоспецифичными фагами может внести вклад в повышение эффективности назначаемой фаговой терапии. Изучение структуры антифаговых генов в «горячей точки 5» ICE SXT элемента позволяет выявлять генетические различия между штаммами V. cholerae О1 биовара Эль Тор, содержащими идентичный набор генов патогенности, пандемичности и антибиотикорезистентности. Полученные данные также указывают на возможность быстрого и точного определения присутствия и типа ICE SXT элемента в штаммах V. cholerae О1 биовара Эль Тор на основе тестирования антифаговых генов в пятой «горячей точке».

1. МУК 4.2.3745–22 «Методы лабораторной диагностики холеры». М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2022. 70 с.