Введение. Одним из наиболее опасных для здоровья населения веществ является аммониевая соль 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-ДА) [1]. В то же время подавляющее большинство исследований оценивает негативное влияние 2,4-ДА на здоровье человека с точки зрения его канцерогенности и тератогенности [2][3], тогда как в литературе появляется все больше сведений о его токсичности в отношении различных органов и систем [4]. В частности, поступление с питьевой водой высоких концентраций 2,4-ДА приводит к изменениям в геноме [5], развитию некроза [6] и апоптоза [7].

Ранее было показано, что потребление животными воды, содержащей 2,4-ДА в малых количествах, вызывало развитие инсулинорезистентности [8], а также нарушения активности ферментов метаболизма жирных кислот [9].

Следует отметить, что, как правило, установленные эффекты 2,4-ДА касаются высоких доз, тогда как имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о необходимости изучения влияния на организм данного хлорорганического ароматического соединения при низких воздействиях. В то же время вопрос, вызывают ли низкие дозы 2,4-ДА при продолжительном введении в организм метаболические нарушения, изучен недостаточно полно, что и послужило основанием для проведения настоящего исследования [10][11].

Цель исследования состояла в оценке развития метаболических нарушений при хроническом воздействии малых доз аминной соли 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в эксперименте.

Материалы и методы. Методологической основой исследования явилось экспериментальное моделирование метаболических процессов, определяющих биохимические параметры крови в организме животного, при воздействии малых доз 2,4-ДА. Исследование продолжительностью 16 недель проводилось в весенне-летний период 2022 года (11.04–31.07).

Экспериментальное моделирование основано на концепции три R (3R), описанной У.М.С. Расселом и Р.Л. Берчем в 1959 году, в которую входят: 1) замена (Replacement), 2) сокращение (Reduction) и 3) усовершенствование (Refinement). В эксперименте использована биологическая модель первого порядка – лабораторные животные, с последующей экстраполяцией данных на человека. Исследование проведено на животных (36 самцов-крыс Vistar). До начала эксперимента масса животных составляла 170 г. Содержание животных осуществлялось в виварии с соблюдением суточного цикла (день/ночь – 12/12). Все животные составляли две группы: группа № 1 – контрольная группа (18 крыс-самцов), группа № 2 – опытная группа (18 крыс-самцов). Животные группы № 2 употребляли питьевую воду, обогащенную 2,4-ДА в концентрации, равной 0,5 ПДК согласно СанПиНу 1.2.3685–211.

На 14-й неделе эксперимента у 50 % экспериментальных животных каждой опытной группы проведен тест на толерантность к глюкозе (ТТГ). Спустя 16 недель животных обеих экспериментальных групп вывели путем декапитации, используя фторотановый наркоз.

Анализ сыворотки крови проведен с использованием оборудования Cobas-6000 фирмы Roche (Швейцария) с применением специальных наборов реагентов. Проведено исследование сыворотки крови на содержание общего белка, альбумина, креатинина, мочевой кислоты, активности аспарагиновой и аланиновой трансаминаз АлАТ и АсАТ, щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), концентрации общего холестерина (ХС) и его фракций – холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), липопротеинов очень низкой и низкой плотности (ЛПОНП и ЛПНП), триацилглицеринов (ТАГ).

Проведенные процедуры с экспериментальными животными, а также условия содержания соответствовали всем этическим нормами и правилам «Европейской конвенции защиты позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, Франция, 1986 год) и лабораторной практики, определенными Минздравом России (приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199н) (заключение локального этического комитета ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России № 291 от 14.02.2022).

Анализ полученных данных проведен с использованием пакета программ Statistica 10.0. Полученные данные концентраций исследуемых компонентов сыворотки крови соответствовали нормальному распределению (использован критерий хи-квадрат). Оценка и представление полученных значение проведено с использованием средней (М) и стандартной ошибки среднего (m). Для оценки достоверности различий применен параметрический t-критерий Стьюдента при р ≤ 0,05.

Ограничение исследования. Данные получены на ограниченном объеме выборки, который составил 36 особей в целом (опыт/контроль), что определяет необходимость проведения более углубленных исследований по оценке метаболических нарушений на репрезентативной выборке, а также в условиях комплексного воздействия изучаемого токсиканта (2,4-ДА). Исследование охватывает неполный перечень показателей, отражающих метаболические сдвиги в организме животных, тем не менее полученные данные в показателях обуславливают перспективы проведения и расширения эксперимента.

Результаты. После завершения эксперимента, через 16 недель полученные результаты, представленные в таблице 1 следует, что у крыс, потреблявших воду, содержащую 2,4-ДА в количестве 0,3–0,4 мкг/кг, отмечалось снижение концентрации белка в сыворотке крови на 24 %, а содержание альбумина было ниже на 10 %, чем в контроле. Содержание мочевины при этом в опытной и контрольной группах находилось в пределах нормы, но вместе с тем было ниже у животных, получавших 2,4-ДА, на 28 %. Уровень сывороточного креатинина в группах не отличался, а мочевой кислоты у крыс, получавших 2,4-ДА, был в 1,7 раза ниже, чем у интактных.

Далее из данных таблицы видно, что поступление в организм животных малых доз 2,4-ДА приводило к увеличению активности сывороточных ферментов, при этом активность АсАТ у крыс опытной группы была на 48 % выше, чем в контроле, АлАТ – на 13 %, ЩФ – на 8,6 %, а ЛДГ – на 22 %.

Длительное поступление малых доз 2,4-ДА не приводило к изменению уровня общего холестерина в сыворотке крови, но оказывало существенное влияние на его распределение по фракциям. Из материалов таблицы видно, что содержание у опытных животных ХС ЛПВП было ниже, чем в контроле, на 16 %. В итоге индекс атерогенности у крыс опытной серии был в 2 раза выше, чем у интактных животных.

Уровень ТАГ у получавших 2,4-ДА крыс был на 18 % соответственно выше, чем в контроле.

Следующий раздел таблицы отражает данные по содержанию в крови животных железа и ферритина. Видно, что длительное поступление в организм 2,4-ДА в малых дозах приводило к снижению сывороточного железа примерно на 20 %. Одновременно с этим концентрация ферритина у опытных животных, напротив, была на 12 % выше, чем у контрольных крыс.

Основные параметры, характеризующие процессы свободно-радикального окисления в сыворотке крови, – спонтанная светимость, амплитуда быстрой вспышки и светосумма – у животных опытной группы были в 2,4; 9,3 и 4,1 раза выше соответственно, чем в контроле. Другими словами, хроническое поступление в организм животных малых доз 2,4-ДА приводило к повышению интенсивности свободнорадикальных процессов, накоплению перекисных соединений и снижению мощности механизмов антирадикальной защиты.

При проведении на 14-й неделе теста на толерантность к глюкозе изменения ее концентрации в крови у интактных животных характеризовались подъемом к 30-й минуте после перорального введения, а затем снижением практически до исходных значений через 2 часа (рисунок).

Из рис. 1 видно, что уровень глюкозы натощак у интактных и опытных животных не отличался.

Кривая, отражающая изменения концентрации глюкозы у получавших 2,4-ДА животных, характеризовалась, во-первых, более высокими значениями к 30-й минуте после перорального введения, а во-вторых, более медленным снижением ее уровня на последующих сроках. При этом к 180-й минуте теста сывороточные значения глюкозы в опытной группе на 1,25 ммоль/л превышали показатели контрольной группы.

Обсуждение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что хроническое поступление в организм с питьевой водой 2,4-ДА в количестве 41–54 мкг/кг приводит к выраженным метаболическим изменениям у животных. Наблюдается повышение уровня маркеров метаболических нарушений, которые впоследствии могут стать причиной развития более серьезных заболеваний.

Данные изменения характеризовались снижением уровня общего белка происходящего за счет фракции альбумина, уровня мочевины и мочевой кислоты, чем в контроле. Эти перечисленные признаки могут свидетельствовать о некотором снижении метаболических процессов, протекающих в печени. Прежде всего, это касается процессов синтеза альбумина и мочевины, а также катаболизма пуриновых нуклеотидов.

Следует отметить, что эти изменения, носящие достоверный характер, происходят на фоне умеренной гиперферментемии, оцениваемой по активности АсАТ, АлАТ, ЩФ и ЛДГ, что может быть свидетельством повышения проницаемости мембран гепатоцитов [12].

С изменением функции печени, вероятно, могут быть связаны и наблюдаемая дислипопротеинемия, проявляющаяся снижением доли антиатерогенной фракции холестерина, представленной ЛПВП и увеличением индекса атерогенности, а также повышению концентрации ТАГ.

Наконец, потребление воды на протяжении 16 недель, содержащей невысокие концентрации 2,4-ДА, приводило к развитию инсулинорезистентности, оцениваемой по тесту на толерантность к глюкозе.

Другими словами, длительное поступление в организм 2,4-ДА в дозах 0,3–0,4 мкг/кг приводило как к изменению уровня маркеров метаболических нарушений, связанных с нарушениями обмена веществ в организме. Таким образом, основными маркерами вероятности развития метаболических нарушений при воздействии гербицида 2,4-ДА на организм животных явились: снижение содержание белка в сыворотке крови; увеличение АсАТ, АлАТ, ЩФ, ЛДГ, ТАГ; снижение сывороточного железа.

Поскольку в исследовании показано развитие окислительного стресса у экспериментальных животных по результатам хемилюминесценции в сыворотке крови, есть основание считать, что малые дозы 2,4-ДА при длительном поступлении в организм реализуют метаболические нарушения через активацию свободнорадикальных процессов.

Согласно современным представлениям, одним из основных механизмов общетоксического действия 2,4-ДА считается его способность вызывать окислительный стресс. Данное состояние, в свою очередь, реализуется под влиянием редокс-активных метаболитов, образующихся в процессе биотрансформации 2,4-ДА в микросомах печени при участии фракции 2Е1 Р450 [13][14]. Следует отметить, что характер превращений не зависит от количества поступающего поллютанта.

Следствием снижения железа может быть нарушение биосинтеза гемоглобина и образования эритроцитов. Механизм, через который длительное поступление малых доз 2,4-ДА вызывает дефицит железа, может быть связан с нарушением его всасывания в кишечнике [15][16]. Известно, что данный процесс регулируется гормоном гепсидином, вырабатываемым в печени, и зависит от его состояния [17]. В свою очередь, образование активных кислородных метаболитов в процессе биотрансформации ксенобиотиков, и в частности 2,4-ДА, может быть одной из причин нарушения структуры и функции гепатоцитов и приводить к нарушению синтеза этого гормона, ответственного за всасывание ионов двухвалентного железа в эритроцитах [18].

В то же время увеличение уровня ферритина в сыворотке крови, которое мы наблюдали у крыс, получавших 2,4-ДА, следует расценивать не с точки зрения повышения запасов железа в организме, а с позиции того, что данный белок является внутриклеточным и его повышение в крови есть результат повреждения гепатоцитов. Такой механизм повышения уровня ферритина в сыворотке крови, не связанный с увеличением запасов железа в организме, был показан при различных заболеваниях печени. Поскольку нами было показано, что повреждение гепатоцитов, оцениваемое по критерию гиперферментемии, происходило при длительном поступлении в организм малых доз 2,4-ДА, есть основание считать, что наблюдаемое в наших исследованиях повышение уровня ферритина в сыворотке крови отражает состояние мембран гепатоцитов, а не гомеостаз железа [19–25].

Заключение. В целом результаты данного исследования позволяют сделать вывод о том, что длительное поступление в организм веществ в количествах, которые принято считать нетоксичными, в частности 2,4-ДА, не остаются незамеченными для организма.

Особенно это положение актуально для ксенобиотиков, процесс биотрансформации которых приводит к образованию токсичных метаболитов. Это обстоятельство, на наш взгляд, делает необходимым изменение подходов к оценке безопасности для организма человека и животных различных поллютантов и их концентрации в окружающей среде.

1 СанПиН 1.2.3685–21 «Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания». М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2022. 668 с.