Введение. Глобальная пандемия коронавируса-19 (COVID-19), вызванная вирусом SARS CoV-2, привела к значительной заболеваемости и смертности во всем мире. В тяжелых случаях, в дополнение к респираторным проявлениям COVID-19, возникают полиорганные нарушения, что делает лечение данной инфекции широко обсуждаемым вопросом [1][2]. В частности, желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), наравне с респираторным трактом может служить начальными «входными воротами инфекции» [3]. Результаты ряда исследований [4] подтверждают, что кишечник и легкие – это органы, имеющие сложные гомеостатические связи. Нарушение целостности кишечного барьера вследствие изменения кишечной микробиоты может привести к транслокации возбудителя инфекции COVID-19 из просвета кишечника в легкие через кровеносную и лимфатическую системы [4][5].

Считается, что причиной системного воспаления может служить вторичный выброс цитокинов, вызывающий цитокиновый шторм [1]. Врожденный иммунитет является первой линией защиты от вторгающихся микробов и включает неспецифический иммунный ответ с привлечением нейтрофилов и макрофагов и выработкой цитокинов и хемокинов. Таким образом, в клетке существует система переноса клеточных сигналов, которые в зависимости от вирулентности возбудителя и функционального состояния клеток хозяина, могут выполнять либо защитную функцию, либо приводить к неконтролируемому воспалению [6]. Фекальный кальпротектин (КП) представляет собой кальцийсвязывающий и в первую очередь специфичный для нейтрофилов белок, который выделяется во внеклеточную среду в результате каскада распада нейтрофилов во время острого воспаления. Концентрация фекального КП, на долю которого приходится 60 % цитозольного белка в нейтрофилах, пропорциональна концентрации нейтрофилов в слизистой оболочке кишечника при ее ишемии [7][8].

Таким образом, фекальный КП может являться потенциальным биомаркером повреждения кишечника у пациентов с COVID-19, кроме того, в зависимости от выраженности КП можно предположить о степени обсемененности ЖКТ микроорганизмами и тяжести протекания заболевания. По данным литературы, более высокие уровни фекального кальпротектина связаны с нарушением метаболической активности микробиоты кишечника. Показателями метаболической активности при этом могут служить короткоцепочечные жирные кислоты, которых было достоверно меньше в группе с повышенным уровнем фекального КП (р = 0,649). Вероятно, это является следствием активного воспаления в кишечнике, которое подавляет колонизацию кишечника нормальной флорой. По данным литературы, выявлена положительная связь между нормальным содержанием кальпротектина (<50 мг/г) и средними значениями (25–75 %) маркеров активности облигатной флоры и анаэробным индексом (p < 0,041) [9].

Цель исследования: оценить маркеры местного и системного воспаления и их взаимосвязь при диарейном синдроме при новой коронавирусной инфекции COVID-19.

Материалы и методы. Под наблюдением находились три группы пациентов (n = 90) в возрасте от 35 до 70 лет с диагнозом «Новая коронавирусная инфекция COVID-19», госпитализированных в инфекционный стационар ГАУЗ СО «ГКБ № 40», г. Екатеринбург. Набор клинического материала проводился в период с мая 2021 по январь 2022 года.

Клиническое исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г.1, Правилами клинической практики в Российской Федерации2. Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на обработку персональных данных и сведений, составляющих врачебную тайну3. Исследование было одобрено на совместном заседании ученого совета и ЛЭК ФГБОУ ВО «УГМУ» Минздрава России4.

Критериями включения в исследование были: подтвержденная инфекция COVID-19 (выявление РНК SARS-CoV-2 с применением методов амплификации нуклеиновых кислот), присутствие клинической картины желудочно-кишечных симптомов, наличие информированного согласия на обработку персональных данных, участие в исследовании.

Критериями исключения были: возраст старше 70 лет, сопутствующая патология: заболевания органов ЖКТ, опорно-двигательного аппарата, хроническая болезнь почек, беременность, ВИЧ-инфекция, онкогематологические и лимфопролиферативные заболевания, кишечная и клостридиальная инфекции.

Пациенты были разделены на три группы в зависимости от концентрации фекального КП, соответствующего уровню интестинального воспаления кишечника: первая группа (n = 30) имела концентрацию фекального КП более 200 мкг/г, вторая (n = 30) – 50–200 мкг/г, третья (n = 30) – менее 50 мкг/г.

При поступлении пациентов в стационар был проведен комплекс лабораторно-диагностических мероприятий, включающий сбор анамнеза, физикальное обследование, исследование концентрации фекального КП, исследование носоглоточной слизи методом полимеразной цепной реакции, пульсоксиметрия с измерением SpO2 для выявления дыхательной недостаточности и оценки выраженности гипоксемии, электрокардиография в стандартных отведениях, общий анализ крови с определением уровня эритроцитов, гемоглобина, гематокрита, лейкоцитов, тромбоцитов, лейкоцитарной формулы, биохимический анализ крови (мочевина, креатинин, электролиты, глюкоза, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), билирубин, альбумин, креатинфосфокиназа (КФК), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), С-реактивный белок (СРБ)), коагулограмма, анализ на иммунный статус с фенотипированием лимфоцитов (СD3+, СD4+, СD8+, NK-клетки), компьютерная томография органов грудной клетки, согласно временным методическим рекомендациям по профилактике, диагностике и лечению СOVID-19 [10, 11].

Критериями оценки эффективности проводимой терапии являлись результаты клинических наблюдений и оценка показателей специфического и неспецифического иммунитета.

Базисная терапия COVID-19 включала назначение противовирусной, иммуносупрессивной, гормональной, антикоагулянтной терапии.

Статистическая обработка полученных данных проводилась на персональном компьютере при помощи пакета прикладных программ «AtteStat», версия 12.5, описание количественных признаков проводилось с использованием параметрических и непараметрических методов. Для проверки наличия нормального распределения использовался тест Шапиро − Уилка. Сравнение независимых групп по количественным признакам с нормальным распределением значений проводилось с использованием классического или модифицированного критерия Стьюдента. При сравнении независимых групп с ненормальным распределением значений одного или двух количественных признаков использовался непараметрический метод с помощью U-критерия Манна – Уитни. Сравнение групп по качественным признакам проводилось с использованием критерия хи-квадрат Пирсона. Критический уровень значимости p был принят равным 0,05. Результаты представлены в виде среднего арифметического значения M и ошибки среднего значения m; при ненормальном распределении в виде Me [Q25 – Q75], где Me – медиана, Q25 и Q75 – соответственно нижний (25,0 %) и верхний (75,0 %) квартили.

Результаты. В нашем исследовании во всех трех группах преобладали лица женского пола: в первой группе пациентов (КП более 200 мкг/г) количество женщин составило 76,6 %, во второй группе (КП 50 – 200 мкг/г) – 73,3 %, в третьей группе (КП менее 50 мкг/г) – 80,0 %. Пациенты были сопоставимы по возрасту: средний возраст пациентов первой группы составил 55,7 ± 1,5 года, второй группы – 52,1 ± 1,5 года, третьей группы – 53,8 ± 1,9 года (p < 0,05).

Среди наблюдаемых пациентов группы были сопоставимы по коморбидному фону: на первом месте преобладали пациенты с артериальной гипертензией (АГ) – 86 %, на втором – пациенты с ожирением 30 %, на третьем – с сахарным диабетом – 23 % и меньшую группу составили пациенты с ишемической болезнью сердца (ИБС) – от 3 % до 13 %, (p < 0,05).

Для унифицированной оценки сопутствующей патологии был использован индекс коморбидности Charlson [12]. Группы пациентов были сопоставимы по данному показателю, который составил в трех группах в среднем 1 и 2 балла: в первой группе – 70,0 % (против 66,6 % второй группы, 70,0 % третьей группы, p > 0,05). В первой группе пациентов среднетяжелое и тяжелое течение новой коронавирусной инфекции COVID-19 встречалось в 1,5 раза чаще, чем во второй группе, и в 2,2 раза чаще, чем в третьей группе пациентов (табл. 1).

По данным компьютерной томографии (КТ) органов грудной клетки, в первой группе уровень КТ-1 был у 33 % пациентов, КТ-2 – у 20 %, КТ-3 – у 47 %; во второй группе: КТ-1 был – у 43 % исследуемых, КТ-2 – у 46 %, КТ-3 – у 10 %; в третьей группе: КТ-1 имели 60 %, КТ-2 – 37 % пациентов, КТ-3 – 3,3 % (p < 0,05).

Таким образом, наиболее выраженно легочное поражение наблюдалось в первой группе пациентов в сравнении с другими группами (p < 0,05).

Клинические проявления новой коронавирусной инфекции в первой группе имели следующие особенности: длительный лихорадочный период до 14,8 ± 0,5 дня (p < 0,05), продолжительный диарейный синдром до 8,7 ± 0,4 дня (p < 0,05), болевой синдром в первой группе сохранялся дольше и соответствовал 6,9 ± 0,8 дня, в сравнении со второй и третьей группами (p < 0,05); диспепсические проявления были выражены в первой и второй группах (7,1 ± 0,3 и 4,7 ± 0,4 дня, по сравнению с третьей группой: 3,8 ± 0,3 дня, p < 0,05) (табл. 2).

Манифестация диарейного синдрома отмечалась в ранние сроки заболевания, а именно на 2,8 ± 0,5 дня болезни в первой группе, во второй группе – 4,1 ± 0,3, в третьей – 5,5 ± 0,6 (p < 0,05).

В остром периоде болезни показатели системного иммунного ответа характеризовались нарастанием уровня С-реактивного белка (CРБ) в 12,2 раза в сравнении с нормой в первой группе, во второй группе – в 8,8 раза, в третьей группе – в 3,6 раза (p < 0,05), нейтрофилёзом ((7,4 ± 0,4) × 109 /л против (6,5 ± 0,26) × 109 /л второй группы, (5,8 ± 0,21) × 109 /л третьей группы, p < 0,05), снижением CD3+ (0,68 ± 0,13 против 0,8 ± 0,08 второй группы, 1,03 ± 0,09 третьей группы, p < 0,05), CD4+ (0,57 ± 0,09 против 0,63 ± 0,06 второй группы, 0,85 ± 0,06 третьей группы, p < 0,05), CD8+ (0,14 ± 0,04 против 0,2 ± 0,02 второй группы, 0,33 ± 0,04 третьей группы, p < 0,05), лимфопенией ((1,5 ± 0,11) × 109 /л против (1,8 ± 0,13) × 109 /л второй группы, (2,6 ± 0,09) × 109 /л третьей группы, p < 0,05) (табл. 3).

В период реконвалесценции происходила нормализация уровня нейтрофилов, CD3+ , CD4+ лимфоцитов во всех группах. Обращает на себя внимания сохраняющаяся CD8+ -лимфопения в первой и второй группах в период реконвалесценции, p < 0,05 (табл. 4).

Кроме этого, в разгар заболевания в группе с КП > 200 мкг/г у 63 % больных отмечался уровень С-реактивного белка более 50 мг/л в сравнении с группой с уровнем КП < 50 мкг/г, в которой у 23 % пациентов наблюдались нормальные показатели СРБ (p < 0,05) (табл. 5).

Анализ коррелятивных связей показал взаимосвязь между уровнем КП и количеством дефекаций (r = 0,7, p < 0,001), уровнем С-реактивного белка (r = 0,8, p < 0,001), уровнем нейтрофилов (r = 0,6, p < 0,05) и моноцитов (r = 0,4, p < 0,05), что может свидетельствовать о наличии связи между маркерами системного и локального воспалительного процессов при новой коронавирусной инфекции. Таким образом, КП может выступать доступным и малоинвазивным маркером для оценки системного воспаления при диарейном синдроме при новой коронавирусной инфекции COVID-19.

В разгар заболевания кишечная микробиота представлена условно-патогенными микроорганизмами. В первой группе пациентов преобладали Escherichia coli (56,6 против 30,0 % второй группы, 20,0 % третьей группы, p < 0,05), Enterococcus faecalis (36,6 против 13,3 % второй группы, 10,0 % третьей группы, p < 0,05), Klebsiella pneumoniae (20,0 против 10,0 % второй группы, 10,0 % третьей группы, p > 0,05), Staphylococcus aureus (10,0 против 3,3 % второй группы, 0,0 % третьей группы, p > 0,05) (табл. 6). Расчет отношения шансов, выявил, что высокий уровень КП увеличивает тяжесть течения новой коронавирусной инфекции в 3,5 раза (ОШ 3,5 95 % ДИ 0,645–18,981).

Обсуждение. Известно, что респираторные вирусные инфекции могут изменять состав кишечной микробиоты посредством иммуномодуляции и предрасполагать пациентов к вторичной бактериальной суперинфекции, являющейся основной причиной тяжелого течения у значительного числа пациентов [13].

Клетки воспаления, в том числе нейтрофилы и лимфоциты, проникают в слизистую оболочку кишечника, что нарушает состав микрофлоры [14][15]. Гистологически верифицировано повреждающее действие COVID-19 на энтероциты кишечника, сопровождающееся воспалительной инфильтрацией [11]. Отмечено, что уровень фекального кальпротектина повышается у пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, что подтверждает, что SARS-CoV-2 вызывает воспаление в кишечнике [16]. Нарушение регуляции кишечной среды в сочетании с воспалением эпителия увеличивает экспрессию ACE2 в кишечнике, и, таким образом, провоспалительное состояние в кишечном микробиоме становится благоприятным для инфекции SARS-CoV-2 [17][18]. В первой группе с высоким уровнем КП в микробиоте кишечника выявлено преобладание Escherichia coli и Enterococcus faecalis в 2,6 и 3,3 раза больше, чем в группе с низким уровнем КП. Возможно, это связано с тем, что локальный воспалительный процесс оказывает влияние на микробиоту кишечника, активируя факультативную флору, которая, в свою очередь, может способствовать нарушению целостности кишечного барьера, усиливая системное воспаление [19][20].

По данным литературы, уровни фекального кальпротектина были выше у инфицированных COVID-19 с продолжающейся диареей, чем у пациентов с прекратившейся диареей и без нее: 123,2 (± 58,8) против 37,2 (±14,4) и 17,3 (±4,8) мкг/г соответственно (p < 0,001) [21]. В нашем исследовании в группе с уровнем КП более 200 мкг/г диарейный синдром манифестировал в 1,9 раза раньше, чем в группе с уровнем КП менее 50 мкг/г (p < 0,05). Кроме того, лихорадка была продолжительнее в 1,7 раза в группе с уровнем КП более 200 мкг/г, чем в группе с уровнем КП менее 50 мкг/г (p < 0,05). Длительность диареи была в 2,5 раза дольше в группе с уровнем КП более 200 мкг/г, чем в группе с уровнем КП менее 50 мкг/г (p < 0,05). Продолжительность (в днях) абдоминального и диспепсического синдромов была больше в 1,5 и 1,8 раза соответственно в группе с уровнем КП более 200 мкг/г, чем в группе с низким содержанием уровнем КП.

Имеются данные, согласно которым у пациентов с COVID-19 было значительно более низкое количество лимфоцитов СD8+ в крови по сравнению со здоровым контролем [22]. Чрезвычайно высокий уровень продукции провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-1β, TNF-α и др.) альвеолярными макрофагами обеспечивает приток большого количества моноцитов и нейтрофилов [23]. В нашем исследовании стартовые показатели моноцитов в группе с уровнем КП более 200 мкг/г в сравнении с группой пациентов с уровнем КП менее 50 мкг/г были ниже нормативных значений в 1,2 раза (p < 0,05) и отмечалось снижение числа CD4+ и CD8+ в 1,4 раза соответственно (p < 0,05). Не исключается, что моноциты рекрутируются в легкие у пациентов с COVID-19 [24], кроме этого, секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) показывает, что классические моноциты являются основным источником цитокинов и хемокинов при тяжелой форме COVID-19 [25].

Заключение

1. Клинические проявления новой коронавирусной инфекции COVID-19, протекавшие на фоне выраженного интестинального воспаления, сопровождались серьезными изменениями легких – на КТ органов грудной клетки. Так, в первой группе КТ-3 встречалось в 46,6 % случаев, во второй в 10,0 %, в третьей – в 3,3 % (p < 0,05). Также наблюдалось увеличение продолжительности лихорадки до 14,8 ± 0,5 дня (p < 0,05), диарейного синдрома – до 8,7 ± 0,4 дня (p < 0,05), болевого синдрома – до 6,9 ± 0,8 дня (p < 0,05), диспепсических проявлений – до 7,1 ± 0,3 дня (p < 0,05).

2. Выявлена положительная корреляционная связь между уровнями кальпротектина и длительностью диарейного синдрома: диарейный синдром манифестировал на 2,8 ± 0,5 дня болезни в первой группе, во второй группе – на 4,1 ± 0,3 дня болезни, в третьей – на 5,5 ± 0,6 дня болезни (p < 0,05), а также в группах с разной концентрацией кальпротектина и выраженностью кишечного воспаления (r = 0,7, p < 0,001). При высоком уровне кальпротектина тяжесть клинических симптомов новой коронавирусной инфекции возрастает в 3,5 раза (ОШ 3,5 95 %, ДИ 0,6–18,9). 

3. Пейзаж условно-патогенной микробиоты кишечника коррелирует с выраженностью воспалительного процесса в кишечнике: в первой группе пациентов преобладали Escherichia coli (53,3 против 26,6 % второй группы, 20,0 % третьей группы, p < 0,05), Enterococcus facials (33,3 против 10,0 % второй группы, 10,0 % третьей группы, p < 0,05).

1. WMA Declaration of Helsinki – Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013. 2. Приказ Минздрава России от 19.06.2003 № 266. 3. Приказ Минздрава России от 12 ноября 2021 г. № 1051н «Об утверждении порядка дачи информированного добровольного согласия на медицинское вмешательство и отказа от медицинского вмешательства, формы информированного добровольного согласия на медицинское вмешательство и формы отказа от медицинского вмешательства». http://publication.pravo.gov.ru/ Document/View/0001202111250019. 4. Протокол № 1/2019 от 25.12.2020.