Введение. Загрязнение воздуха рабочей зоны на металлургических и других промышленных предприятиях наночастицами (НЧ) различной химической природы встречается повсеместно. Набирает обороты использование нанотехнологической продукции, что в совокупности обуславливает серьезную опасность для здоровья человека, связанную с воздействием НЧ [1][2]. Частицы нанометрового диапазона (от 0 до 100 нм) легко проникают в организм при вдыхании и откладываются в различных тканях и органах, в том числе в головном мозге. Однако патофизиологические реакции НЧ in vivo на функцию мозга на данный момент изучены недостаточно.

Согласно современным литературным данным, НЧ обладают способностью проходить через барьеры организма, включая гематоэнцефалический. Именно это в том числе обуславливает потенциальную опасность частиц нанометрового диапазона для различных нервных структур и может быть причиной разнообразных нарушений функционирования центральной нервной системы (ЦНС) [3–5]. Так, было показано, что интраназальное введение НЧ оксида титана (TiO2) приводит к изменению амплитудных и спектральных характеристик электроэнцефалограммы (ЭЭГ) головного мозга, а также влияет на поведенческие реакции крыс, что свидетельствует об их возможном нейротоксическом эффекте [6]. В другом исследовании было отмечено, что ежедневная внутрижелудочная экспозиция крыс линии Wistar водной суспензией нанодисперсного оксида марганца (Mn3O4) через зонд в дозах 260, 50, 10 мг/кг массы тела в сутки на протяжении 90 дней приводила к появлению ряда негативных эффектов, характеризующих развитие нарушений нервной системы. Исследователи отмечали нарушение в соотношении нейромедиаторов, проявляющееся снижением активности гамма-аминомасляной кислоты и повышением концентрации глутамата в сыворотке крови. При гистоморфологической оценке наблюдали повреждение мембран астроцитов и нейронов, очаговую демиелинизацию нервных волокон. В сосудах отмечали полнокровие и локализованные дистрофические изменения эндотелия. Кроме того, при указанном воздействии нанодисперсного оксида марганца зафиксированы субарахноидальное кровоизлияние, отек головного мозга с расширением периваскулярных и перицеллюлярных пространств [7]. При ингаляционном воздействии наночастиц оксида свинца (PbO) на крыс в концентрации 1,30 ± 0,10 мг/м3 4 часа/день на протяжении 5 дней была обнаружена задержка наночастиц в обонятельных луковицах головного мозга, демиелинизация аксонов и вакуолизация цитоплазмы нейронов [8].

Для оценки НЧ как фактора риска для здоровья человека важны сведения о влиянии НЧ различной химической природы на поведенческие реакции экспонированных организмов. Поэтому целью нашей работы является проведение сравнительного анализа изменений функций ЦНС у крыс после субхронического внутрибрюшинного воздействия на них наночастиц оксидов Ni, Mn, Cu, Zn, Pb, Si, Ti по результатам поведенческих тестов.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования были проведены в соответствии с международными требованиями, касающимися этичного обращения с животными, задействованными в биомедицинских исследованиях, в том числе Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 года). Исследования были одобрены локальным этическим комитетом и проводились на белых аутбредных крысах, исходная масса тела которых составляла порядка 220 г, при этом разброс по массам крыс не превышал 20 %.

В серии экспериментов субхронические интоксикации моделировались путем повторных внутрибрюшинных инъекций суспензий наночастиц с частотой введения 3 раза в неделю (всего 18 введений) при однократной дозе, равной 2,5 мг наночастиц на 1 кг массы тела. Выбор дозы опирался как на результаты литературного поиска, так и на ранее проведенные собственные исследования нашего коллектива: использованная нами доза, с одной стороны, с высокой вероятностью гарантировала проявление интоксикации к концу экспозиционного периода, а с другой – не вызывала страданий у лабораторных животных. Контрольные животные получали инъекции физиологического раствора.

После завершения экспозиционного периода для оценки функции ЦНС у крыс было выполнено 2 теста: «метод открытой площадки» и суммационно-пороговый показатель (СПП).

«Метод открытой площадки» является модифицированным физиологичным методом определения ориентировочной реакции крыс, в основу которого положен «норковый рефлекс». С его помощью возможна оценка двигательного компонента ориентировочной реакции и эмоциональной реактивности животных в новых условиях. При интерпретации оценивается число заглядываний в отверстия, поскольку сдвиг поведенческого реагирования позволяет выявить значительные нарушения в нервно-мышечной, вегетативной, когнитивной и сенсорной системах и оценить функциональные изменения, связанные с вредным воздействием. Суть теста заключается в обследовании отверстий (заглядывании в «имитированные» норки) или засовывании головы внутрь отверстий «по глаза» с помощью находящейся на полу площадки – расчерченного квадрата со сторонами, равными 1 метру, и высотой 45 см, в котором имеются 16 углублений. Крысу отпускают в сектор, расположенный в центре поля, и в течение 3 мин фиксируют количество заглядываний в отверстия1. Известно, что тест, оценивающий норковый рефлекс для грызунов, выступает ранним показателем устойчивости экспериментальных животных к воздействию токсинов и характеризует их приспособительные реакции [9].

Суммационно-пороговый показатель (СПП) отражает одномоментно два важнейших параметра возбудимости, а именно лабильность нервных центров, влияющую на способность к суммации импульсов при заданном постоянном интервале между ними, и порог сгибательного рефлекса, который отражает способность центральной нервной системы суммировать подпороговые импульсы. При определении СПП лабораторное животное помещалось на площадку с горизонтальными пластинами всеми 4 лапами при нулевом напряжении, и, как только крыса успокаивалась, на прибор подавался нарастающий ток (с частотой импульсов 0,5 Гц; интервал между импульсами ½ сек.) до тех пор, пока испытуемая особь не одернет одну из лап. Как только животное поднимало лапку, фиксировали значение напряжения. Показателем служит суммационное число (количество импульсов, не более 19,0), требующееся для вызова рефлекторного движения [10]. Для измерения СПП нами был использован импульсатор ИСЭ-01.

Статистическая значимость различий между среднегрупповыми результатами оценивалась по t-критерию Стьюдента. Контрольные значения считали в каждой серии экспериментов за 1,0, а опытные группы отклонения – от 1,0 в меньшую или большую сторону.

Результаты. В тесте «метод открытой площадки» после воздействия на крыс элементоксидными НЧ было выявлено снижение исследовательской активности животных во всех опытных группах (см. рис. 1), которое характеризовалось уменьшением частоты заглядываний в «норки» в сравнении с контрольными значениями. Изученные НЧ по влиянию на упомянутый показатель можно распределить следующим образом (от большей степени выраженности к меньшей): Mn > Pb > Ni > Ti > Si > Zn > Cu. Наиболее низкие и статистически достоверные с контролем значения наблюдались у животных, подвергшихся воздействию НЧ Mn3О4, NiO и PbО, что может свидетельствовать о более высокой нейротоксичности этих НЧ. Обнаружены статистически значимые различия изученного показателя у животных, подвергшихся воздействию НЧ Mn3О4, с животными, подвергавшихся воздействию НЧ NiO, ZnO, CuO и SiO2.

При оценке суммационно-порогового показателя выявлено его повышение у животных после воздействия НЧ NiО, Mn3О4, CuО, ZnО, PbО по сравнению с контрольной группой, но статистически значимое увеличение отмечено у группы после воздействия CuO, ZnO (см. рис. 2). Выявлены статистически достоверные различия между СПП после воздействия Mn3О4 и CuО, SiO2; NiO и CuО, SiO2; PbO и SiO2; ZnO и SiO2TiO2; CuO и SiO2 TiO2. Изученные НЧ по влиянию на упомянутый показатель можно распределить следующим образом (от большей степени выраженности к меньшей): Cu > Zn > Pb > Ni > Mn > Ti > Si.

Обсуждение. Снижение исследовательской активности у крыс, подвергавшихся воздействию НЧ Mn3O4, PbO, NiO, может быть следствием проникновения этих НЧ в структуры головного мозга с последующим нарушением их функций. Вероятно, имеет место нарушение функций гипоталамуса, гиппокампа, двигательной коры больших полушарий, префронтальной области коры, нейромедиаторной системы и связей между ними [11][12]. Аналогичные изменения подкорково-корковых связей нейронов упомянутых структур встречаются у людей при болезни Альцгеймера [13].

В реализации когнитивных задач и, соответственно, формировании поведенческих реакций играет одну из ключевых ролей -ритм (1–4 Гц), который может изменяться под влиянием интоксикации. Показана способность НЧ оксида титана изменять биоэлектрическую активность нейронов головного мозга, в частности префронтальной области коры. Изменения выражались в наблюдаемом у крыс через 30 дней после интраназального введения НЧ преобладании медленноволновой активности θ TiO2 [14]. По мнению авторов, появление подобных ритмов (медленноволновых θ- и -ритмов) относится к неблагоприятным признакам и может быть тесно связано с дистрофическими, демиелинизирующими и дегенеративными поражениями головного мозга, снижением активизирующих влияний ствола головного мозга [15].

Стоит отметить, что угнетение двигательной активности может быть и проявлением защитного торможения, возникающего у животных в ответ на развивающийся стресс, который может быть вызван интоксикацией [16][17].

Несмотря на данные научной литературы о возможности НЧ TiO2 влиять на функцию головного мозга [6, 14], нами не было обнаружено статистически значимых изменений исследовательской активности крыс, что может быть объяснено следующим образом. В исследовании Шарафутдиновой и соавт. животные подвергались воздействию НЧ в дозе, существенно превышавшей использованную нами как при воздействии в течение 14 и 30 дней (разовая доза составляла 50 мг/кг м. т.) [6], так и при однократном пероральном введении (7500 мг/кг м. т.) [14].

Увеличение СПП у крыс, подвергшихся воздействию изученных элементоксидных НЧ, может говорить как о процессах торможения и угнетения функции ЦНС, так и о нарушении проведения импульса по нервному волокну, которое может быть вызвано повреждением миелиновой оболочки аксонов, неоднократно продемонстрированном после эксцизии к НЧ [18–20]. Кроме того, ухудшение проводимости и приводит к ошибкам в передаче сигнала аксонами, которые обуславливают различные поведенческие отклонения [21].

В тесте по изучению исследовательской активности крыс и оценке СПП отмечены статистически значимые изменения показателей в условиях разных экспозиций: Mn3O4, PbO, NiO и CuO, ZnO. Воздействие на функцию ЦНС по разным показателям отмечено у разного перечня веществ, вероятно, ввиду особенностей химической природы изученных НЧ, а именно приоритетным их действием на разные «точки приложения» в нервной системе.

Заключение. При субхроническом внутрибрюшинном воздействии НЧ оксидов элементов Mn, Ni, Si, Cu, Zn, Ti, Pb в однократной дозе 2,5 мг/кг м. т. у аутбредных белых крыс были выявлены изменения величины суммационно-порогового показателя и частоты заглядываний в «норки» в тесте «метод открытой площадки».

При ранжировании изученных НЧ по степени вызываемых изменений от большей степени выраженности к меньшей исследовательская активность снижается при воздействии Mn > Pb > Ni > Ti > Si > Zn > Cu, а уровень СПП – при Cu > Zn > Pb > Ni > Mn > Ti > Si. Это может быть объяснено особенностями химической природы изученных НЧ, а именно приоритетным их действием на разные «точки приложения» в нервной системе.

Проведенный анализ данных по выявлению изменений в поведенческих реакциях крыс после внутрибрюшинного введения им НЧ расширит представления о нейротоксическом действии этих токсикантов, что позволит провести углубленную и более надежную оценку риска для здоровья человека.

1. МР 2166-80 «Методические рекомендации по использованию поведенческих реакций животных в токсикологических исследованиях для целей гигиенического нормирования», утв. Заместителем Главного государственного санитарного врача СССР А.И. Заиченко 14.04.1980 № 2166-80