Введение. Трудно переоценить актуальность работ, связанных с изучением сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), которые занимают первое место среди причин смертности населения во всем мире уже долгие годы [1]. Изменение образа жизни людей за последнее время привело к увеличению заболеваемости ожирением, гипертонией и диабетом, что повышает риск сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) [2]. В осложнении большинства уже имеющихся ССЗ играет роль наличие в организме атеросклеротического поражения сосудов, результатом которого является инфильтрация эндотелия сосудов липидами, воспаление, образование пенистых клеток и некротического ядра, повышенное тромбообразование, что впоследствии может закончиться разрывом фиброзной оболочки бляшки и закупоркой сосудов.

В период ранней стадии образования атеросклеротического поражения, которая происходит бессимптомно, сложно обнаружить патологические изменения, однако изучение метаболомного профиля крови, который отражает даже незначительные изменения в обмене веществ во время протекающих патологических процессов, может помочь в предсказании наличия заболевания на ранних стадиях и предотвратить возможные последствия и осложнения.

Авторами работы ранее был проведен литературный обзор, в котором изучался вопрос молекулярных механизмов атеросклероза и был описан предполагаемый перечень метаболитов-биомаркеров заболевания, который охватывает многие процессы обмена веществ, потенциально сигнализирующих о развитии поражения сосудов [3].

Цель: проведение предварительного исследования в рамках моделирования гиперлипидемии и гиперхолестеринемии in vivo для изучения изменений метаболома крови крыс и поиск новых биомаркеров атеросклеротического поражения сосудов.

Материалы и методы

Животные, индуцирование атеросклероза и сбор образцов. В эксперименте были использованы аутбредные крысы, рожденные в марте 2022 года. Исследование проводилось с мая по август 2022 года, для него было отобрано 30 самцов белых крыс в возрасте 6–7 недель с массой тела 240–250 г, из которых составили две группы: опытную (n = 15) и контрольную (n = 15). Моделирование атеросклероза у крыс опытной группы проводилось посредством гиперлипидемического рациона питания, состоящего из 72,95 % стандартного корма, 12 % свиного жира, 5 % сахара и 10 % яичного порошка с фармакологическим воздействием 0,05 % Тиамазола, на 15-й день эксперимента животным в течение 2 дней с кормом вводилось по 90 000 МЕ витамина D3. Крыс из контрольной группы на протяжении всего эксперимента кормили стандартным рационом. Через 7 недель с забором крови из эксперимента была выведена часть животных опытной (n = 8) и контрольной (n = 10) групп, после 11 недель оставшиеся животные были выведены из эксперимента. Цельная кровь хранилась при –80 °С до анализа.

Дизайн эксперимента на животных составлен с учетом современных требований биоэтики и был одобрен Локальным этическим комитетом ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП Роспотребнадзора (Протокол № 1/1 от 09.06.2022).

Пробоподготовка. Перед анализом образцы крови размораживали при комнатной температуре. Депротеинизация проводилась добавлением 600 мкл метанола к 200 мкл плазмы с последующим перемешиванием в течение 30 секунд. Далее пробы инкубировали в течение 15 минут при 4 °С и центрифугировали 15 минут на 14 000 об/мин при 4 °С. 50 мкл супернатанта отбирали для УВЭЖХ-МС анализа. Анализ проб с концентрированием проводили с использованием 200 мкл супернатанта, которые упаривали при комнатной температуре в течение 3 часов в вакуумном концентраторе, после чего сухой остаток перерастворили в 50 мкл смеси ацетонитрил/вода (3:1) c 0,1 % муравьиной кислотой при перемешивании и воздействии ультразвука. Далее проводили центрифугирование 15 минут на 14 000 об./мин при 4 °С, супернатант отбирали для УВЭЖХ-МС анализа.

Анализ сыворотки на холестерин липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛПНП), ХС липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП), триглицериды (ТГ) и общий ХС проводили на автоматическом анализаторе с использованием коммерческих наборов.

Хроматографическое разделение. Для хроматографирования использовали систему ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии (УВЭЖХ) Agilent 1290 Infinity II с масс-спектрометрическим детектором Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF. Разделение проводилось на колонке InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 2,1 × 100 мм зернением 1,9 мкм со скоростью потока 0,4 мл/мин при температуре колонки 35 °С. Подвижная фаза состояла из воды с 0,1 % муравьиной кислотой (фаза А) и ацетонитрила с 0,1 % муравьиной кислотой (фаза Б) со следующими параметрами элюирования: 0–5 мин – 5 % (Б), 5–23 мин – от 5 до 100 % (Б), 23–29 мин – 100 % (Б), 29–30 мин – от 100 до 5 % (Б), 30–35 мин – 5 % (Б). Объем пробы – 5 мкл.

Масс-спектрометрия. Масс-спектрометрическое детектирование осуществлялось в положительном режиме ионизации на тандемном квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре с электрораспылением. Диапазон сканирования составлял 20–1000 m/z с частотой съемки 1 спектр в секунду. Данные собирали с помощью программного обеспечения (ПО) Agilent MassHunter Data Acquisition. С целью аннотации соединений проводили МС/МС эксперимент для получения фрагментных спектров с энергией столкновения 0, 10 и 20 V. Обработку полученных данных проводили в ПО Agilent MassHunter Workflow и Agilent MassHunter Navigator.

Аннотацию метаболитов проводили по точной моноизотопной массе (ppm ˂ 10), изотопному распределению пиков и подтверждению спектра фрагментации по библиотекам спектров Human Metabolome Database (HMDB)1 и LIPID MAPS2 в ручном режиме.

Статистический анализ. Метаболомные данные анализировались в ПО Mass Profiler Professional c помощью t-критерия Стьюдента, значимыми принимали изменения с p ˂ 0,05 и кратностью изменения сигнала FC ˃ 1. Статистическая обработка остального материала проводилась с помощью ПО IBM SPSS Statistics 23 по непараметрическому критерию Манна – Уитни с уровнем значимости p ˂ 0,05.

Результаты

Метаболомное профилирование крови. Среди метаболитов, которые изменили содержание в течение эксперимента, фигурируют глицерофосфолипиды, жирные кислоты, ацилкарнитины, желчная кислота, стерол, олигопептид и производные идола. На 7-й неделе эксперимента удалось зафиксировать изменения в уровне содержания 16 метаболитов, на 11-й неделе эксперимента снизилось содержание еще двух ацилкарнитинов и двух окисленных фосфатидилхолинов (РС) (см. табл. 1).

Масса животных. По мере увеличения длительности эксперимента вес животных опытной группы увеличивался (табл. 2) и статистически значимо отличался от веса животных контрольной группы (p ˂ 0,05).

Исследование липидного спектра сыворотки крови. У животных на выбранном рационе питания наблюдали повышение показателей липидного профиля относительно животных контрольной группы (см. рис.) с уровнем значимости p ˂ 0,05.

Исследование липидного спектра сыворотки крови. У животных на выбранном рационе питания наблюдали повышение показателей липидного профиля относительно животных контрольной группы (см. рис.) с уровнем значимости p ˂ 0,05.

Общий анализ крови. В эксперименте имело место изменение 15 из 20 измеряемых показателей крови (см. табл. 3), данные приведены для показателей, имеющих статистически достоверные различия между группами с уровнем значимости p ˂ 0,05. После 11 недель опытная группа отличалась от контрольной лишь по увеличению индекса распределения эритроцитов (RDW-SD) с р = 0,016 (данные не представлены).

Обсуждение. В связи с тем что у крыс отсутствует белок переноса холестеринового эфира (CETP), ЛПВП являются основными переносчиками холестерина (ХС) в плазме, в результате чего крысы устойчивы к атеросклерозу как вид и, как правило, гипочувствительны к чистому диетическому ХС. Поэтому гиперлипидемию и атерогенез у крыс можно индуцировать рационом с высоким содержанием ХС, жиров, холевой кислоты и гипотиреоидными лекарственными препаратами. В качестве антитиреоидного препарата был выбран Тиамазол, который снижает содержание тиреоидных гормонов в крови: в норме данные вещества стимулируют экспрессию рецепторов ЛПНП в печени за счет белков, связывающих стерол-регулирующие элементы (SREBP-2), либо напрямую. Гипотиреоз же приводит к снижению количества рецепторов ЛПНП и, как следствие, снижению их захвата, а значит, увеличению содержания в крови общего ХС и ХС-ЛПНП [4][5].

Также для индуцирования атеросклероза у крыс рацион дополняется перорально вводимыми избыточными дозами витамина D, гипервитаминоз которого, совместно с гиперхолестеринемическим рационом, является артериотоксичным и может вызывать кальцификацию сосудов [6]. У всех животных присутствовали симптомы гипервитаминоза, среди которых были вялость, апатичность, потеря аппетита. Три крысы были выведены из эксперимента на третий день после приема витамина D, остальные восстановились в течение нескольких суток.

Гипергликемия может ускорить формирование атеросклеротического поражения [7]. Эндотелий особенно чувствителен к изменениям концентрации глюкозы. Гликозилирование белков и липидов нарушает их конформацию и нормальную функцию, как упоминалось нами ранее [3]. Воздействие гипергликемии наиболее выражено в присутствии воспалительной среды и гиперлипидемии.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что кормление крыс выбранным рационом с повышенным содержанием жиров и углеводов вызывает изменение биохимических и гематологических показателей, массы тела животных, а также метаболомного профиля крови.

Именно на основании полученных результатов эксперимента мы полагаем, что к моменту завершения эксперимента животные находились в состоянии начальной стадии атеросклероза, когда еще не все системы гемо- и гомеостаза подверглись изменениям, а эндотелий, вероятно, еще не подвергся инфильтрации макрофагами. В связи с этим мы считаем, что обнаруженные нами метаболиты можно отнести к ранним маркерами атеросклеротического поражения сосудов. Содержание некоторых метаболитов противоречит литературным данным и предполагаемым в нашем литературном обзоре изменениям [3]. Возможно, это связано именно с тем, что они являются биомаркерами начальной метаболической перестройки в ответ на развивающуюся гиперлипидемию.

Офтальмовая кислота (офтальмат) является аналогом глутатиона, в котором тиольная цистеинового остатка заменена на метильную. Офтальмат образуется из 2-аминобутирата путем последовательных реакций с гамма-глутамилцистеинсинтетазой (GCS) и глутатионсинтетазой (GS) как побочный продукт реакции образования глутатиона (GSH). В эксперименте по индуцированию окисления тиоловых групп и перекисного окисления липидов (ПОЛ) было показано, что данные процессы приводят к активации GCS, что, в свою очередь, индуцирует синтез GSH и офтальмата [8]. Однако последний не подвергается дальнейшему метаболизму из-за отсутствия тиоловой группы и, тем самым, накапливается в организме. В связи с этим повышенное содержание офтальмовой кислоты может свидетельствовать о наличии в организме окислительного стресса, что согласуется с механизмами атеросклеротического поражения сосудов.

Мы наблюдаем снижение в экспериментальной группе животных двух производных индола, который является метаболитами триптофана, индолакриловой кислоты и индол-3-карбоксальдегида. Предположительно, это связано с тем, что при воспалении повышается секреция индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), которая ответственна за катаболизм триптофана по кинурениновому пути, тогда как на индольный путь триптофана расходуется меньше [3]. Ранее уже было показано, что пациенты с атеросклерозом имеют более низкие уровни производных индола в плазме [9].

Ранее мы описывали накопление ацилкарнитинов и свободных жирных кислот при атеросклерозе, связанное с нарушением β-окисления из-за нарастающей гипоксии и энергетического дисбаланса, что, вероятно, проявляется уже при глубоких поражениях эндотелия [3], тогда как в некоторых литературных данных встречается информация о снижении ацилкарнитинов. Полученные в эксперименте изменения показывают обратную тенденцию – ацилкарнитины и жирные кислоты, независимо от длины ацильной цепи, имели пониженное содержание у животных на гиперлипидемическом рационе питания. Такое расхождение с теоретическими данными может объясняться тем, что эндотелий еще не подвергся глубоким изменениям и липидной инфильтрации, а снижение связано с поступлением большого количества углеводов в виде сахарозы. При этом обе найденные жирные кислоты являются полиненасыщенными, оттого представляются легкими мишенями для ПОЛ, что может служить еще одной причиной их снижения и вносить их вклад в усугубление окислительного стресса.

Увеличение уровня желчной кислоты и стерола происходит из-за избыточного поступления ХС, т. е. элиминация ХС из организма происходит в виде желчных кислот и стеролов для компенсаторного его снижения. Направление изменения согласуется с другими исследованиями [10].

В большой доле исследований, связанных с изучением метаболома при атеросклерозе, сообщается об изменении в содержании глицерофосфолипидов, но изменения эти часто неоднозначны, и ведутся дискуссии по поводу того, обладают эти сигнальные молекулы атерогенными или антиатерогенными свойствами. Мы также обнаружили изменения разной направленности в содержании этих молекул в крови животных из экспериментальной группы. Положительная связь с гиперлипидемическим рационом питания была установлена для двух лизофосфатидилхолинов (LPC): LPC (O-18:0/0:0) и LPC (20:3); снижение уровня было обнаружено для четырех других LPC: LPC 1(9:0), LPC (20:0), LPC (20:1) и LPC (16:1); уменьшилось содержание двух окисленных фосфатидилхолинов (PC): PC (22:2;O2) и PC (23:2;O2) и двух молекул лизофосфатидилэтаноламинов (LPE): LPE (16:1) и LPE (18:1). LPC (O-18:0/0:0), так называемый lyso-PAF, является предшественником фактора, активирующего тромбоциты (PAF), и продуктом его катаболизма. Сам PAF экспрессируется тромбоцитами, эндотелиальными клетками, моноцитами и макрофагами. PAF является провоспалительным фактором, приводит к синтезу и высвобождению цитокинов, факторов роста, активных форм кислорода и активных форм азота, экспрессии интегринов и селектинов, что способствует активации и агрегации тромбоцитов и лейкоцитов, активации эндотелиальных клеток, повышению адгезии, инвазии и миграции воспалительных клеток, что впоследствии и приводит к эндотелиальной дисфункции и усугублению атеросклеротического поражения. В результате для предотвращения нарастающего окислительного и воспалительного коллапса организм, возможно, на начальных стадиях развития атеросклероза подавляет образование такого мощного провоспалительного метаболита, как PAF, посредством его гидролиза до lyso-PAF.

Различия в результатах исследований связывают с различной биологической активностью LPC в зависимости от длины ацильной цепи и ее насыщенности. Более того, было показано, что множество зарегистрированных провоспалительных эффектов, приписываемых LPC, на самом деле возникают из-за PAF-подобной активности примесей в некоторых коммерческих препаратах LPC: когда эти препараты подвергались воздействию PAF-ацетилгидролазы или омылению по остатку sn-2, провоспалительная активность препаратов LPC нивелировалась [11]. В последнее время появляется все больше публикаций, сообщающих о связи низкого уровня LPC с неблагоприятными исходами ССЗ. В нашем же исследовании наблюдается общая черта в снижении LPC и LPE – все они содержат в своем составе насыщенные жирные кислоты (НЖК) и мононенасыщенные жирные кислоты (МНЖК), тогда как LPC с полиненасыщенной жирной кислотой (ПНЖК) показал тенденцию к увеличению содержания в крови животных опытной группы. Нет четкой тенденции в изменении уровня глицерофосфолипидов при атеросклеротических поражениях, в исследованиях одни и те же LPC имеют изменения разной направленности [12][13]. Снижение же уровня LPC подтверждает гипотезу о том, что данные вещества являются субстратом для производства лизофосфатидной кислоты (LPA) за счет быстрого превращения в биологических жидкостях, тканях и живых клетках под действием аутотаксина. LPA способна передавать сигналы через рецепторы, связанные с G-белком, и участвовать в хроническом воспалении, фиброзных заболеваниях и тромбозе [14]. Возможно, именно LPA, а не LPC ответственен за сообщаемые атерогенные эффекты LPC [15]. Пониженные уровни LPC также можно объяснить снижением их синтеза в печени по отрицательной обратной связи из-за повышенной липидной нагрузки.

LPE же на данный момент мало изучены, и их функции в организме точно пока не установлены, что затрудняет интерпретацию полученных нами результатов по их вкладу в атерогенез, однако ранее уже наблюдалось их снижение [16].

При классической картине атеросклероза присутствует выраженная гиперлипидемия, которая проявляется в повышении уровня ХС-ЛПНП, общего ХС и ТГ на фоне снижения ХС-ЛПВП и чаще всего наряду с малоподвижным образом жизни и избыточным весом. Масса тела животных опытной группы была выше в сравнении с контрольной группой, а после 4 недель наблюдалось и биохимическое подтверждение нарастающей гиперлипидемии – повышение уровня общего ХС, ХС-ЛПВП и ТГ. Уровень же ХС-ЛПНП изменился лишь через 7 недель эксперимента, что можно объяснить тем фактом, что главным переносчиком ХС у крыс является ЛПВП, чье увеличение было заметно сразу же, тогда как эффект Тиамазола на снижение количества рецепторов ЛПНП в печени был выражен через некоторое время вкупе с нарастающей гиперлипидемией. С этим также связано отсутствие характерного для атеросклероза снижения уровня «антиатерогенных» ЛП.

Результаты общего анализа крови также показали признаки формирования атеросклеротического поражения. Повышение уровня лейкоцитов в опытной группе свидетельствует о в оспалительной реакции, которая является одним из ведущих механизмов развития атеросклеротического поражения сосудов. Увеличение уровня лейкоцитов на 4-й неделе объясняется повышенным содержанием лимфоцитов, при этом абсолютное содержание других лейкоцитов, к которым относятся эозинофилы, базофилы и моноциты, не изменяется. Роль лимфоцитов в атерогенезе доказана, однако можно предположить, что именно лимфоциты ответственны за иммунный ответ на начальных стадиях, что также соответствует другим исследованиям [17]. В дальнейшем же лимфоциты могут ограничивать и приглушать воспалительный ответ, тогда как гранулоциты и моноциты будут способствовать увеличению поражения сосудов. Об отсутствии существенных патологических изменений можно судить по сопоставимому с контрольной группой содержанию моноцитов, которые дифференцируются в макрофаги для захвата липопротеинов в месте липидной инфильтрации эндотелия [18]. Однако после 11 недель эксперимента в опытной группе замечено 1,5-кратное увеличение показателя MID % относительно контрольной группы (данные не представлены), но без статистической значимости (p = 0,063). Эта информация также служит основанием полагать, что формирование очага поражения началось лишь к 3 месяцам питания гиперлипидемическим рационом, тогда как мы наблюдаем проявления начальной стадии атерогенеза еще до поражения сосудов.

Среди полученных результатов есть и те, что подтверждают изменение реологии крови. К таким маркерам относятся тромбоцитарные и эритроцитарные индексы. Так, присутствуют изменения структуры популяции тромбоцитов, которые появляются после 7 недель эксперимента, выражающиеся в увеличении индекса среднего объема клеток (MPV) и индекса распределения (PDW), которые связывают с функциональной активностью тромбоцитов. В результате активации дисковидная форма тромбоцитов меняется на сферическую, появляются псевдоподии, что ведет к увеличению их размеров и степени анизоцитоза. Считается, что большие тромбоциты метаболически и ферментативно более активны и поэтому имеют больший протромботический потенциал. PDW отражает гетерогенность популяции по размерам. Увеличение MPV связывают с дисфункцией эндотелия и коронарным атеросклерозом [19]. Повышение тромбокрита же в свою очередь сигнализирует об увеличении тромбоцитарной массы и повышенной свертываемости крови.

Параллельно этому, эритроцитарные индексы, такие как средний объем (MCV) и индекс распределения (RDW), увеличены в опытной группе, что объясняется анизоцитозом. Содержание же эритроцитов как в абсолютном, так и в относительном количестве снижено в опытной группе животных. Можно предположить, что наблюдается нарушение синтеза и созревание эритроцитов и гемоглобина из-за воспаления, что объясняет разброс в размерах эритроцитов и говорит о нарушении в системе гемостаза [20].

Ограничения исследования. Для более детального понимания того, в каком состоянии находился эндотелий сосудов, необходимо проведение гистологического исследования аорты и печени животных, а также анализ крови на уровень содержания глюкозы для представления общей картины состояния здоровья животных и исключения отягощающей патологии. Помимо этого, в числе ограничений исследования стоит упомянуть малое количество особей, включенных в исследование, – с учетом полученных данных, эксперимент с большим количеством животных покажет более достоверный результат.

Заключение. В результате поставленного эксперимента по индуцированию атеросклероза у крыс были получены данные, характеризующие различные аспекты заболевания, которые касаются гиперлипидемии, воспаления, окислительного стресса, реологии крови и массы тела животных. В ходе исследования были обнаружены метаболиты, которые могут служить потенциальными биомаркерами протекающих патологических изменений: офтальмат сигнализирует о повышенной окислительной нагрузке на организм; производные индола – о воспалении; изменение уровня жирных кислот и ацилкарнитинов может быть как реакцией на избыточное поступление диетических жиров, так и свидетельствовать о неизвестных пока молекулярных механизмах; глицерофосфолипиды говорят о возможном воспалении и изменении состояния мембран некоторых клеток. Полученные сведения дополняют и расширяют предыдущие работы, описывающие протекание атеросклеротического поражения сосудов, однако точная интерпретация результатов требует дополнительных исследований.

1. HMBD (База данных метаболомов человека). [Электронный ресурс] Режим доступа: https://hmdb.ca/ (дата обращения: 11.07.2023). 2. Липидные карты. [Электронный ресурс] Режим доступа: https://www.lipidmaps.org/ (дата обращения: 11.07.2023).