Введение. Общий подъем индустриализации, а также агрохимический прогресс в сельском хозяйстве приводят к общей «химизации» среды обитания и, как следствие, к повышению роли химико-аналитического контроля при решении проблем взаимодействия человека с окружающей средой. В этом случае происходит непроизвольное расширение номенклатуры как объектов исследования, так и числа антропогенных ксенобиотиков. Среди них загрязнители, воздействующие на среду обитания на чрезвычайно низком уровне (нижний предел обнаружения – 10–10–10–11 %), таких токсичных соединений, как фураны [1]. Опасность фуранов для человека и окружающей среды обусловлена целым рядом свойств: токсичность, устойчивость к разложению, способность к биоаккумуляции, предрасположенность к атмосферному переносу на большие расстояния. В организм человека из воздуха и с пылью поступает ежедневно 3 пг/день фурана (российская ПДК фурана для атмосферного воздуха – 0,5 пг/м3) и его производных, если рядом есть постоянные источники стойких органических загрязнителей (СОЗ) [2–4].

Фураны входят в перечень основных экополютантов, составляющих ксенобиотический профиль [5]. Высокая канцерогенность и мутагенность фуранов даже при низких концентрациях в организме человека, порядка 10–12–10–15 г/кг, могут создавать реальную угрозу здоровью настоящего и будущих поколений.

Концентрация фуранов по мере перемещения по пищевой цепочке может возрастать в тысячи и десятки тысяч раз. В связи с этим возникает необходимость его качественного и количественного контроля [6][7]. Кроме того, фуран является гетероциклическим органическим промышленным химическим и пищевым загрязнителем. Канцерогенные эффекты фурана объясняются генотоксическими и негенотоксичными механизмами; накопленные данные показали возникновение устойчивого гипометилирования цитозиновой ДНК, гиперметилирования промоторной области в генах-супрессорах опухолей и вилочковой коробке E1 (FOXE1) и деацетилирования гистона H3 в лизинах 9 и 56 в печени при воздействии фурана. Это указывает на то, что эпигенетические изменения не являются случайным событием и играют фундаментальную роль в гепатобилиарном канцерогенезе, связанном с фураном [8–12].

Концентрация фуранов по мере перемещения по пищевой цепочке может возрастать в тысячи и десятки тысяч раз [13][14]. Проведение биомониторинга с использованием современных прецизионных аналитических методик контроля содержания токсичных соединений в биологических средах направлено на совершенствование системы контроля качества, оценки риска и безопасности объектов окружающей среды, что, в свою очередь, будет способствовать сохранению здоровья населения [15][16].

Актуальность разработки методики определения потенциально опасных фурана и метилфурана в крови заключается во внедрении методологии биомониторинга в РФ для повышения объективности оценки вреда здоровью в условиях химического загрязнения окружающей среды на базе существующей системы социально-гигиенического мониторинга в учреждениях Роспотребнадзора во взаимодействии с лечебными учреждениями Минздрава РФ.

Цель исследования – разработка и валидация авторской методики количественного определения потенциально опасных фурана и метилфурана в крови человека для обеспечения контроля за содержанием экзогенных соединений в биологических средах, для выполнения работ по оценке риска здоровью населения при воздействии химических веществ.

Материалы и методы исследования. Предметом исследований являлись биосреда (гемолимфа человека), технологическая разработка хромато-масс-спектрометрической методики: экспериментальном установлении хромато-масс-спектрометрических условий анализа фурана и метилфурана с использованием стандартного образца на капиллярных колонках различной полярности и способы подготовки биопробы (кровь) для химического анализа, изучении степени экстракции методом «введено-найдено», количественного определения и валидации методики. Период разработки методики определения фурана и метилфурана в крови составил январь – июль 2023 г.

Химические материалы и реагенты: фуран и метилфуран (Sigma-Aldrich), массовая доля основного вещества фурана и метилфурана ≥ 99,0 %; гептан нормальный эталонный (ГОСТ 25828-831); газообразный гелий марки «А», в баллонах (ТУ 20.11.11-002-01868373); газообразный азот осч (чистота 99,996 %).

Инструменты и условия анализа: хромато-масс-спектрометрическая система, («ХроматэкКристалл» (Россия)) в составе: хроматограф с отечественным квадрупольным масс-спектрометрическим (масс-селективный) детектором, режим Split ratio азот: воздух – 12,5, температура ионного источника – 200 °С, температура квадрупольного масс-анализатора – 150 °С, ток эмиссии – 70 эВ; кварцевая колонка серии DB-5MS 60 m × 0,250 mm × 0,250 µm.

Этапы исследования:

1 – экспериментальная отработка хромато-масс-спектрометрических условий определения фурана и метилфурана с применением стандартных растворов;

2 – выбор органического растворителя для исследований;

3 – изучение зависимости полноты экстракции фурана и метилфурана из биоматериала (кровь) методами экстракции органическим растворителем;

4 – количественное определение гетероциклов в крови.

Экспериментальная отработка хромато-масс-спектрометрических условий анализа фурана и метилфурана в пробах крови

Регулируя полярность соответствующим подбором неподвижных жидких фаз или используя капиллярные колонки с различными по полярности НЖФ, можно достигать высокой эффективности разделения.

Экспериментально отработаны и подобраны условия разделения фурана, метилфурана и сопутствующих компонентов на кварцевых капиллярах для хроматографических колонок, заполненных неподвижными жидкими фазами с различными характеристиками: полярная цианопропильная фаза, слабополярная фаза с покрытием нитротерефталевой кислотой и DB-5MS 60 m × 0,250 mm × 0,250 µm, на которой было достигнуто разделение фурана и метилфурана. Хроматографическое разделение компонентов пробы основывается на селективности сорбента и термодинамических свойствах аналитов по отношению к хроматографической системе. На селективность оказывает влияние температура, а на эффективность влияет скорость потока газа-носителя. С увеличением температуры снижается селективность, но при этом повышается эффективность. В процессе разделения фурана и метилфурана во времени применяли режим программирования температуры колонки, т. е. температуру капиллярной колонки повышали от 40 до 200 °С со скоростью 40 °С/мин, что позволило разделить и выделить все компоненты биологического образца.

Результаты. В условиях эксперимента были отработаны расход газа-носителя с делением потока азот:воздух и без деления потока азот:воздух. Диапазон сканирования выполнен от 37 до 150 а.е.м. Результаты экспериментально отработанных условий хроматографирования представлены в табл. 1.

Эффективное разделение следовых количеств легколетучих органических соединений (фуран и метилфуран) основано на экспериментально отработанных оптимальных газохроматографических параметрах и вводе пробы в поток газа-носителя с делением потока с коэффициентом деления 12,5 (режим 2, табл. 1). Хроматограмма стандартного раствора фурана и метилфурана при отработанных хромато-масс-спектрометрических условиях анализа представлена на рис. 1.

Использование органического растворителя для экстракции фурана и метилфуран из биологической среды (кровь)

Метод экстракции – процесс изолирования органическими растворителями химических соединений из различных биообъектов [15].

Сложность экстракции фурана и метилфурана из крови обусловлена достаточно высокой степенью связывания данных соединений с белками крови (50–60 %) [17]. Поэтому для изолирования фурана и метилфурана из крови применяли ряд органических полярных и неполярных растворителей и изучали влияние различных факторов на эффективность экстракции фурана и метилфурана из крови: объем экстрагента и биосреды, температуру экстракции, водородный показатель (рН) биосреды, высаливающие агенты.

Выбор органического растворителя. Для выбора экстрагента для извлечения фурана и метилфурана из крови использовали ряд органических растворителей различной полярности и изучали зависимость степени экстракции. Результаты экспериментальных исследований представлены в табл. 2.

Максимальная полнота извлечения фурана и метилфурана 62–86 % (табл. 2) из крови достигнута при использовании в качестве растворителя гептана.

Объем экстрагента. Максимальная степень извлечения фурана и метилфурана из образца крови установлена при уменьшении объема органического растворителя (экстрагента) Vорг. Результаты представлены в табл. 3.

Полученные результаты (табл. 3) показали, что при использовании органического растворителя гептана в объеме 1,0 см3 для экстракции степень извлечения из крови составила для фурана 62,8 % и для метилфурана 86,7 %.

Изучение зависимости степени экстракции фурана и метилфурана из цельной крови и плазмы от объема биоматериала и органических растворителей

Изолирование токсичных соединений методом экстракции проводили из цельной крови. Экспериментально установлена степень извлечения фурана и метилфурана из пробы крови с применением стандартного образца в зависимости от объема органического растворителя и объема крови (табл. 4).

Анализ полученных результатов (табл. 4) показал, что использование 1 см3 экстрагента (гептан) и 2,5 см3 крови, 2 последовательных экстракций в течение 5 минут и центрифугировании пробы крови в течение 10 минут при 5000 об./мин позволило достичь степени экстракции для фурана 77 % и метилфурана 91 %. При использовании плазмы крови полнота извлечения фурана и метилфурана составила для фурана 15 % и для метилфурана 16 %.

Изучение зависимости степени экстракции фурана и метилфурана из крови от высаливающих агентов (электролитов)

Для повышения степени извлечения фурана и метилфурана из проб крови использовали ряд нейтральных солей щелочных и щелочноземельных металлов: сульфат и хлорид натрия, гидрофосфат аммония и смесь солей (4 г MgSO4 безводного, 1 г NaCl, 1 г натрия лимоннокислого трехзамещенного и 0,5 г натрия лимоннокислого двузамещенного, 1,5 водного, общий вес 6,5 г) [18].

Средние значения полноты экстракции фурана и метилфурана из крови с применением нейтральных солей представлены в табл. 5.

При использовании высаливающих агентов удалось достичь извлечение фурана и метилфурана из крови не более 67 % (табл. 5).

Изучение зависимости степени экстракции фурана и метилфурана из крови от рН

Экстракция органических соединений из биосреды зависит в том числе от водородного показателя (рН среды). При экстракции недиссоциированные молекулы переходят в органическую фазу, повышая тем самым полноту извлечения органического соединения из биосреды.

С целью максимального извлечения фурана и метилфурана из крови и установления параметров экстракции в экспериментальных исследованиях применяли и подкисление неорганической кислотой и подщелачивание щелочью щелочноземельных металлов биопробы для разрушения связей фурана и его производных с белками крови. При взаимодействии фурана и его производных с сильными кислотами уменьшается стабильность кольца – фурановое кольцо расщепляется и полимеризуется [19]. Неустойчивость фурана в кислой среде сопровождается сильным осмолением и промежуточным образованием диеновых соединений. Вместе с тем фуран устойчив к действию щелочей щелочноземельных металлов, и поэтому фурановое кольцо не разрушается [20]. Полученные результаты представлены в табл. 6.

Применение в качестве экстрагента гептана (табл. 6) объемом 1 см3 и 10 % р-ра щелочи (NaOH) позволяет повысить степень экстракции фурана и метилфурана из образца крови до 98 %.

Валидационные характеристики биоаналитической методики. С использованием отработанного способа подготовки образцов крови к химическому анализу фурана и метилфурана проведена оценка пригодности (валидация) разработанной методики в деятельности испытательной лаборатории по перечисленным ниже характеристикам: специфичность (specificity); предел обнаружения (detection limit) (LOD); предел количественного определения (quantitation limit) (LOQ); аналитической области (range); линейности (linearity); правильности (trueness) и прецизионности (precision) согласно ГОСТ ИСО/ МЭК 17025-20092.

Основным руководством по валидации методики является драфт-руководство Европейского медицинского агентства (ЕМА) 2009 г.3.

Для доказательства специфичности аналитической методики определения фурана и метилфурана в крови проводили анализ биологической жидкости, к которой предварительно прибавляли стандартный раствор определяемых веществ в таком количестве, чтобы их содержание в пробе находилось в предполагаемом диапазоне концентраций, и летучие органические соединения: этанол, пентан, гексан, бензол, ксилол. В процессе исследований установлено, что определению фурана и метилфурана в крови не мешают летучие органические соединения: этанол, пентан, гексан, бензол, ксилол и др.

Полученные результаты анализа оценивали по соотношению «сигнал/шум» на хромато-масс-спектрометрической системе.

Для определения пределов (LOD) обнаружения фурана и метилфурана в крови проводили эксперимент, заключающийся в том, что готовили стандартные образцы фурана и метилфурана на уровне нижнего диапазона концентраций и вносили стандарт в пробы крови, приготовленные для анализа.

Пределы обнаружения для фурана и метилфурана определяли по хроматограмме, используя величины стандартных отклонений сигнала, и по угловому коэффициенту калибровочного графика. Предел обнаружения (ПО) находили по уравнению:

ПО = 3,3 · S/b,

где S – стандартное отклонение аналитического сигнала; b – коэффициент чувствительности, представляющий собой отношение аналитического сигнала к определяемой величине (тангенс угла наклона калибровочной кривой).

Для фурана предел обнаружения (LOD) составил 0,00011 мкг/см3, для метилфурана = 0,000021 мкг/см3.

Предел количественного определения (LOQ) рассчитывали по уравнению: ПКО = 10 × S / b, где S – стандартное отклонение аналитического сигнала; b – коэффициент чувствительности, представляющий отношение аналитического сигнала к определяемой величине [21–24].

По рекомендациям CITAC за предел определения принимали величину 10 So.

Предел количественного определения LOQ для фурана в крови составил Сlim = 0,0011 мкг/см3. Для метилфурана LOQ в крови составил Сlim = 0,00021 мкг/см3.

Аналитическая область методики. Определение содержания фурана и метилфурана в образцах крови выполняли методом градуировочного графика. Для этого готовили 3 серии шкал стандартов и с помощью программного обеспечения строили градуировку, которая имела линейную зависимость при среднем квадратическом отклонении повторяемости (СКО) не более 10.

Диапазон экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели, составил 0,0019– 0,09 мг/дм3.

Линейность методики. Линейность разработанной методики в диапазоне измеряемых концентраций проверяли экспериментально измерением аналитических сигналов для 3 серий шкал с различными концентрациями определяемых соединений. Экспериментальные данные обрабатывали методом наименьших квадратов с использованием линейной модели:

y = b × x + a,

где х – количество или концентрация определяемого вещества;

y – величина отклика (сигнал компонента на хроматограмме);

b – угловой коэффициент;

a – свободный член (ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента»).

Рассчитаны и представлены величины: угловой коэффициент (b) и коэффициент корреляции (r). Использовали линейные зависимости, отвечающие условию |r| ≥ 0,99 с доверительной вероятностью Р = 99,9 %.

Установленные значения погрешности (и ее составляющих) измерений по разработанной методики представлены в табл. 7.

Установленные показатели, характеризующие составляющие бюджета неопределенности или погрешности измерений (табл. 7), составили: показатель точности для фурана – 12,76 %, для метилфурана – 12,88 %, показатель повторяемости для фурана – 17,89 %, для метилфурана – 16,98 %, показатель внутрилабораторной прецизионности для фурана – 5,98 %, для метилфурана – 6,04 %.

Изолирование фурана и метилфурана из крови методом жидкость-жидкостной экстракции

Кровь объемом 2,5 см3 помещали в пробирку объемом 10 см3, пробу подщелачивали 10 % раствором NaOH. Затем добавляли 1 см3 полярный растворитель гептан и экстрагировали в течение 5 минут. Пробу центрифугировали при 5000 об./мин в течение 10 минут и экстракт анализировали методом хромато-масс-спектрометрии.

Обсуждение. Авторская методика включала два этапа исследований:

1 – разработка высокочувствительной и селективной хромато-масс-спектрометрической методики определения токсичных фурана и метилфурана в крови;

2 – валидация разработанной методики в условиях лаборатории.

На основании выполненных исследований разработана и валидирована в условиях лаборатории высокочувствительная и специфичная методика газохроматографического определения фурана и метилфурана в крови с масс-спектрометрическим детектированием. Диапазон измеряемых концентраций фурана и метилфурана в крови составил 0,0019–0,09 мг/дм3 при погрешности 22 %.

Нормы метрологических характеристик (относительной погрешности и относительного стандартного отклонения) для разработанной аналитической методики составляют не более 15 и не более 9,5 % для уровня концентраций, соответствующих пределу количественного определения (ПКО), что соответствует требованиям драфт-руководства ЕМА4.