Введение. Государственное управление системой здравоохранения и обеспечения здоровья населения является важным, краеугольным элементом общественного здравоохранения. Несмотря на то что на первое место по экономическому и социальному ущербу в мире и в Российской Федерации вышли заболевания сердечно-сосудистой системы, инфекционные заболевания продолжают быть серьезной проблемой для здравоохранения многих стран мира. Кроме этого, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) отмечает тревожную тенденцию к общему замедлению темпов борьбы с инфекционными заболеваниями [1].

Одним из наиболее эффективных средств борьбы с инфекционными заболеваниями остается вакцинация. По данным ВОЗ плановая вакцинация ежегодно спасает жизнь и здоровье 3 миллионам детей в мире. С помощью новых вакцин, которые будут разработаны в ближайшие 5–10 лет, можно будет предотвратить гибель еще 8 миллионов детей в год [2][3]. По данным исследований вакцинация предупредила как минимум 14,4 миллиона (95 % доверительный интервал [Cl] 13,7–15,9) смертей от COVID-19 в 185 странах и территориях только в период с 8 декабря 2020 года по 8 декабря 2021 года [4].

Новые и вновь возникающие инфекционные вирусные заболевания угрожали человечеству на протяжении всей истории, например натуральная оспа долгое время занимала одно из первых мест среди инфекционных заболеваний из-за высокой смертности и инвалидизации переболевших, или же новая коронавирусная инфекция COVID-19, которая с 2020 по 2022 г. уже унесла жизни более 6,5 миллиона человек. Несколько взаимосвязанных и синергетических факторов, включая демографические тенденции и урбанизацию с высокой плотностью населения; модернизацию, способствующую высокой мобильности людей, использующих скоростные виды транспорта; увеличивающиеся возможности организации мероприятий с большим скоплением людей; изменения окружающей среды с модификацией экосистем, – все это ускоряет появление и распространение опасных для человека патогенов в современном мире. Анализ последних эпидемий (пандемический грипп 2009 г., лихорадка Эбола 2014–2016 гг., COVID-19) показывает, что наибольшую опасность представляют вирусы с пандемическим потенциалом. Для ускоренной разработки противовирусных лекарственных препаратов и повышения их эффективности важно получить детальные знания о пространственной структуре вирусных белков и их комплексов, формирующихся при инфицировании организма человека вирусами, а для качественного проведения клинических и доклинических испытаний биопрепаратов важен своевременный подбор чувствительных животных моделей и изучение патогенеза инфекционного заболевания на них. Все эти исследования могут быть проведены с использованием нового мощного исследовательского инструмента – источника синхротронного излучения (ИСИ).

Биологические исследования с использованием ИСИ напрямую и/или косвенно через получение фундаментальных знаний стимулируют поиск новых и усовершенствованных методов профилактики и лечения, которые преодолеют некоторые ограничения современных лекарств против различных инфекционных вирусных заболеваний. Строительство дополнительных ИСИ в Российской Федерации, таких как Сибирский кольцевой источник фотонов (СКИФ) поколения 4+ в Кольцово Новосибирской области, рядом с Государственным научным центром вирусологии и биотехнологии «Вектор», значительно повысит доступность таких исследований для ученых в области вирусологии и молекулярной биологии и укрепит реализацию столь важной для Российской Федерации миссии по обеспечению национальной биологической безопасности, краеугольным камнем которой является быстрое реагирование на вновь возникающие вирусные угрозы.

В настоящее время в мире насчитывается более 70 различных ИСИ, многие из них применяются для разносторонних исследований живых систем, однако результатов исследований, проводимых с вирусами, получено крайне мало. Это можетбыть объяснено тем, что выполнение таких работ зачастую требует определенного уровня биологической защиты лаборатории ИСИ, в котором проводятся исследования. На данный момент в мире не существует ни единой лаборатории при ИСИ с уровнем защиты BSL3/BSL4, позволяющим проводить исследования с особо опасными вирусами, такими как вирус натуральной оспы, эболавирусы, высокопатогенные для человека варианты вируса гриппа (H5, H7, H9), коронавирус SARS-CoV-2, вирус клещевого энцефалита и другие. В скором времени в России будет построен СКИФ, на котором будет реализована станция с уровнем биозащиты BSL3, поэтому непосредственной целью данного обзора являлось рассмотрение возможностей существующих ИСИ для проведения вирусологических исследований и применение ИСИ для создания и повышения эффективности противовирусных лекарственных препаратов.

Материалы и методы. Был проведен поиск литературы об использовании синхротронного излучения в вирусологии и его значимости для общественного здравоохранения в будущем с использованием ключевых слов «синхротронное излучение, вирусология, микротомография животных, гистология, белковая кристаллография» в поисковой системе PubMed, по базам данных Scopus, Web of Science и базе данных белковых последовательностей PDB за период с 1996 по 2022 г. Однако данный обзор охватывает более широкий исторический период времени, начиная с упоминания о получении пространственной структуры миоглобина кашалота 1958 г. [5], которое послужило основой для начала рентгеноструктурных исследований белков. Критерий отбора: статьи, посвященные использованию рентгеновских методов, реализованных на источниках синхротронного излучения, в вирусологии, биологии и белковой кристаллизации. Итоговая выборка после углубленного анализа первоначально отобранных источников литературы состоит из 51 полнотекстового материала и официально взятой информации из Всемирной организации здравоохранения и ESRFnews – European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), которые удовлетворяют вышеуказанному критерию.

Результаты

1. Поколения источников синхротронного излучения На сегодня существует четыре поколения ИСИ.

Первое поколение – синхротроны, построенные для экспериментов по физике высоких энергий, где синхротронное излучение было побочным явлением. На этих установках впервые начали отрабатываться методики применения синхротронного излучения в научных исследованиях. Второе поколение – синхротроны, специально построенные для генерации синхротронного излучения при помощи поворотных магнитов. Первым таким ИСИ стал Tantalus, запущенный в 1968 г. в США. Третье поколение – это ИСИ сегодняшнего дня, где устройствами для генерации когерентного синхротронного излучения являются специальные устройства – вигглеры и ондуляторы. Условно ИСИ третьего поколения можно разделить на три группы. Первая группа – это синхротроны с малой энергией до 3 ГэВ: BESSY II в Германии с энергией до 1,7 ГэВ [4], SOLEIL во Франции с энергией 2,75 ГэВ[6] и компактный источник света MuCLS в Германии с энергией от 15 кэВ до 35 кэВ [7]. Примерами второй группы синхротронов с энергией 3 ГэВ являются ASP в Австралии [8], ALBA в Испании [9] и Diamond Light Source в Великобритании [10]. И третья группа синхротронов – это расположенные в Японии SPring-8 с самой высокой в мире энергией 8 ГэВ [11] и расположенный и США APS с энергией 7 ГэВ [12].

Совсем недавно во Франции появился самый высокоэнергичный в Европе ИСИ четвертого поколения ESRF с энергией 6 ГэВ [13]. Рентгеновские лазеры на свободных электронах (XFEL, Германия) обещают открыть новые возможности в биологических исследованиях. Они производят рентгеновские лучи с исключительными свойствами: их пиковая яркость на 9–10 порядков выше, а длительность импульса в 1000 раз меньше, чем у существующих в мире линий синхротронного излучения. Дифракционные картины могут быть зарегистрированы от микрои нанокристаллов еще до того, как радиационное повреждение начнет разрушать образцы. Используя эту концепцию «дифрагировать перед разрушением», возникла новая область биологии XFEL, в которой, как предполагается, будут решаться биологически важные вопросы, выходящие за рамки того, что возможно с использованием традиционных ИСИ [14–16]. Вместе взятые, ИСИ и XFEL представляют собой мощный набор инструментов, которые позволят проводить передовые структурно-биологические исследования сложных молекул и молекулярных механизмов.

В настоящее время в мире насчитывается более 70 различных ИСИ, многие из которых полностью или в значительной степени предназначены для генерации синхротронного излучения для использования в таких областях, как материаловедение, исследования полупроводников, геология, неорганическая кристаллография, кристаллография малых молекул и, все чаще, структурная биология и микротомография живых объектов. В России на сегодня действуют два источника СИ – в НИЦ «Курчатовский институт» в Москве («КИСИ-Курчатов») и в Институте ядерной физики им. Г.И. Будкера СО РАН в Новосибирске (Сибирский центр синхротронного и терагерцевого излучения – ускорители ВЭПП-3, ВЭПП-4).

2. Использование ИСИ в биологии

Развитие структурной биологии и возможность экспериментального решения пространственного строения белков стало настоящим прорывом для вирусологии и медицины в целом. Понимание того, как расположены атомы в молекуле белка и какие взаимодействия их объединяют, дает возможность целевым образом работать со структурой белка и, следовательно, менять его функции. Это позволило ученым всего мира отойти от метода почти «слепого» перебора при создании лекарственных и противовирусных препаратов и перейти к их рациональному дизайну, основываясь на определении конкретной лекарственной мишени, воздействие на которую будет оказывать терапевтический эффект (технология Drug-Design). Начало экспериментальному получению трехмерной структуры белков было положено еще в 1958 г., когда впервые была определена пространственная структура миоглобина кашалота [5]. Первым препаратом, созданным с помощью дизайна пространственной структуры, стал дорзоламид, являющийся ингибитором карбоангидразы [17]. Недавно данный препарат стали также рассматривать как новый агент против устойчивых к ванкомицину энтерококков, являющихся основной причиной инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи и представляющих серьезную угрозу для общественного здравоохранения [18]. На сегодня с помощью методов экспериментального получения пространственных структур белков, в том числе и рентгеновской кристаллографии, ставшей основным инструментом структурной биологии, были собраны целые базы данных, содержащие уже решенные трехмерные белковые структуры и позволяющие ученым проводить теоретический поиск лекарственных мишеней. Одной из таких баз является Protein Data Bank (PDB) [19]. Тем не менее стоит понимать, что для получения достоверных знаний о взаимодействии лекарства с патогеном и их воздействии на организм одних теоретических расчетов недостаточно. Необходимо проведение множества экспериментов. Сверхъяркие источники рентгеновского излучения, такие как будущий СКИФ со значением эмиттанса 0,075 нм•рад, позволяют с высокой скоростью просвечивать исследуемые объекты, и таким образом у ученых появится возможность в режиме реального времени следить за столь быстротекущими процессами, как взаимодействие вируса с противовирусным препаратом, ингибирующим его репликацию в организме человека, а также в динамике детально изучать течение вирусных инфекций на модельных животных [20].

2.1. Рентгеновская томография животных

Рентгеновское изображение широко используется для неинвазивного выявления внутренних структур тела и может обеспечить лучшее пространственное разрешение, чем другие неинвазивные методы. Благодаря этим возможностям рентгеновское изображение стало важным диагностическим инструментом в медицинских клиниках, но области его использования продолжают расширяться [21].

Фазово-контрастная рентгенография (PCXI) – это новый метод визуализации, который может значительно улучшить рентгенографию для медицинской визуализации. PCXI позволяет анализировать структуры мягких тканей, визуализируя фазовые градиенты в рентгеновском волновом поле, такие изображения невозможно получить с помощью обычной компьютерной томографии (КТ) [22–26]. Метод значительно улучшает контрастное разрешение структур мягких тканей, что принципиально важно, когда речь идет об изучении инфекционного процесса на модельных лабораторных животных, а также при проведении доклинических исследований противовирусных препаратов и вакцин.

PCXI дает возможность визуализации мягких тканей без необходимости использования контрастных веществ или в дозе примерно в 400 раз ниже, чем требуется для стандартной КТ, при этом максимально достижимое разрешение на сегодня составляет ~ 1 мкм. Исследования, проведенные на модели восьминедельных самок мышей C57BL/6N, показали, что поток и когерентность квазимонохроматического рентгеновского луча, обеспечиваемого ИСИ, позволяют получать фазово-контрастные изображения, просто увеличивая расстояние от образца до детектора [27]. Другие исследования продемонстрировали, что PCXI является эффективным инструментом изучения мозга мелких животных, обеспечивая получение изображений структур тканей с высоким разрешением и четким разграничением серого и белого вещества [28–31]. Croton L. и соавт. с помощью линии луча с поворотным магнитом BL20B на SPring-8 (Хёго, Япония) получили первую in situ визуализацию мозга крольчонка в 30-дневном гестационном возрасте [32]. На этой же установке BL20B SPring-8 другой группой авторов были отработаны методики исследования противораковых препаратов на лабораторных животных с привитыми опухолями in vivo (рис. 1А) [33]. На линии луча BL13W Шанхайского центра синхротронного излучения (SSRF, Шанхай, КНР) были отработаны методики исследования сосудистых заболеваний человека на мышиной модели in vivo (рис. 1В) [34].

Синхротронные исследования лабораторных животных, которые описаны выше, играют ключевую роль в разработке новых вакцин и противовирусных препаратов. Прежде чем перспективные вакцины-кандидаты можно будет испытывать на людях, их сначала необходимо проверить на безопасность и эффективность на животных. При этом важно, что исследования при помощи ИСИ дают более четкую картину происходящих при введении препарата процессов и возможность зафиксировать любые патологические изменения в организме животного как в результате поражения вирусом, так и при негативном воздействии самого испытываемого препарата.

2.2. Трехмерная рентгеновская гистология (3D-гистология)

Биологические ткани имеют сложную структуру на каждом (от органного до субклеточного) уровне организации [34]. Изучение архитектуры тканей и клеточной морфологии играет важную роль в биологических и медицинских исследованиях. Трехмерная визуализация ткани (3D-гистология) при классических гистологических методах ранее была затруднена и требовала серийных ультратонких срезов тканей, анализ которых отнимал много времени и сил исследователя (рис. 2). Однако благодаря прогрессу в рентгеновской микроскопии получение объемной визуализация ткани стало возможным. Построение модели на микротомографическом изображении с разрешением от клеточного до субклеточного может выявить структурную основу биологической функции, заложенную в трехмерном изображении [35].

С быстрым развитием синхротронного излучения и детекторов рентгеновского излучения синхротронная рентгеновская фазово-контрастная томография (SR-XPCT) была успешно использована для изучения онкологических и других заболеваний. SR-XPCT позволяет визуализировать даже самые незначительные изменения в морфологии и плотности мягких тканей, после чего микроциркуляторные и нейронные сети могут быть успешно реконструированы с помощью методов обработки снимков без подготовки срезов и окрашивания образцов ткани [36][37]. С использованием метода синхротронной рентгеновской фазово-контрастной томографии на ИСИ EBS ESRF (Гренобль, Франция) было получено первое трехмерное изображение ткани легкого мужчины, пострадавшего от COVID-19, с разрешением 2 мкм, что примерно в 100 раз лучше, чем разрешение клинических изображений компьютерной томографии1 .

Картирование больших нейронных сетей мозга животных и человека является фундаментальной, но до сих пор труднодостижимой задачей из-за огромного количества данных и, как следствие, непомерно длительного времени получения и обработки изображений. Для решения этой проблемы была разработана эффективная стратегия под названием «AXON» (ускоренное рентгеновское наблюдение нейронов), которая успешно реализована параллельно на всех установках синхротронного излучения Национального исследовательского центра синхротронного излучения NSRRC, включая Тайваньский источник света (TLS), Тайваньский источник фотонов (TPS), SPring-8 в Японии, Сингапурский источник синхротронного света (SSLS) и источник света PLS-II в Корее. Возможности AXON, в частности, позволили за несколько дней выполнить полное 3D-картирование мозга дрозофилы, однако эта стратегия может обеспечить полное картирование головного мозга в реалистичной временной шкале даже крупных животных и человека [38].

На ИСИ BESSY II в Германии были получены нанотомографические изображения культуры клеток PtK2, инфицированной вирусом оспы коров (ВОК). На рис. 3 показаны клетки PtK2, инфицированные штаммом ВОК, экспрессирующим зеленый флуоресцентный белок, вместе со структурами, появившимися в результате деятельности вируса: вирусными фабриками и двумя типами вирусных частиц, относящихся к разным ступеням созревания ВОК (незрелые и зрелые частицы) [39].

Все эти примеры показывают, что ИСИ поколения 3, 4 и более, например такие, как СКИФ, дают возможность получать качественные объемные изображения тканей организма в реальном времени с высоким разрешением, оставляя далеко позади трудоемкую технологию выявления патологических изменений при изучении ультратонких гистологических срезов.

2.3. Структура вирусных белков

Все структурные исследования вирусных белков делятся на два больших кластера методов в зависимости от того, кристаллизуется белок или нет. В данном разделе мы рассмотрим только методы, использующие рентгеновские лучи.

Первый метод – это классическая рентгеновская кристаллография, появление которой в свое время сделало прорыв в изучении трехмерных структур макромолекул. Примерно с начала 2000-х гг. вирусные белки начали активно исследовать с помощью синхротронного излучения. Так, в 2000 г. на линии BM14 Европейского источника синхротронного излучения (ESRF, Гренобль, Франция) была получена структура матриксного белка VP40 вируса Эбола [40]. Позднее, в 2007 г., на модернизированной линии BM14CRG ESRF былаполучена кристаллическая структура С-концевого димерного домена белка VP30 вируса Эбола, который взаимодействует с вирусным нуклеокапсидом и активирует синтез вирусной мРНК в инфицированной клетке [41]. В 2017 г. на линии 12-2 Стэнфордского синхротронного источника света (SSRL, Калифорния, США) была решена пространственная структура домена олигомеризации белка VP35 вируса Марбург [42], а на линии BL17U Шанхайского центра синхротронного излучения (SSRF, Шанхай, Китайская Народная Республика) – нуклеопротеина вируса Марбург [43]. Филовирусы (марбургвирус и эболавирусы Заир, Судан, Бундибуджио и Тай Форест) вызывают тяжелое лихорадочное заболевание у людей с высокой летальностью, которая может достигать 90 %. Данные о структуре вирусных белков обеспечивают понимание механизмов проникновения вируса в клетку и его репликации при инфицировании человека, что дает важную информацию для разработки терапевтических средств против этих особо опасных инфекций.

Другим ярким примером важности ИСИ в структурной биологии является беспрецедентная мобилизация усилий по оперативному определению топологии белков во время пандемии COVID-19. По состоянию на 2022 г. в базе данных PDB имеется более 1200 структур белков, связанных с новым коронавирусом SARS-CoV-22 . Большинство этих структур было определено с помощью рентгеновской кристаллографии на ИСИ, причем первые структуры были депонированы еще до того, как 11 марта 2020 г. ВОЗ объявила о пандемии COVID-19. Среди них есть структуры цистеиновой и основной протеазы Mpro, которые необходимы для репликации и транскрипции вируса и, следовательно, представляют собой важные терапевтические мишени для ингибирования размножения SARS-CoV-2 [44]. Кроме того, быстро появилось большое количество других пространственных структур, важных для разработки вакцин и противовирусных препаратов, например структура рецептор-связывающего домена RBD в комплексе с человеческим ангиотензин-превращающим ферментом 2 (ACE 2), обеспечивающим детальное структурное понимание начальных этапов инфекции. Кристаллографический скрининг сотен химических соединений на линии I04 Diamond Light Source в Великобритании позволил быстро отобрать из них потенциальные ингибиторы SARS-CoV-2 [45]. Эти результаты в совокупности дали детальную информацию о структуре вирусных белков, являющихся основными мишенями, что послужило основой для экспресс-разработки препаратов против COVID-19.

Тем не менее белковая кристаллография имеет свои ограничения: не всегда удается получить крупные кристаллы, в особенности когда речь идет о выращивании микрокристаллов мембранных белков, которые являются мишенями большинства лекарств, и не только противовирусных [46]. Эта проблема была частично решена с появлением фемтосекундной кристаллографии, основанной на сверхкоротких и чрезвычайно интенсивных рентгеновских импульсах лазеров на свободных электронах (XFEL), предопределивших новый исследовательский потенциал в различных научных областях. Это привело к открытию рядановых структур рецепторов, связанных с G-белком (GPCR) [47, 48].

В случаях, когда белки не удается кристаллизовать, для их изучения может быть использовано малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР). МУРР представляет собой экспериментальный метод определения структурных характеристик биомакромолекул в растворе [49]. Поскольку образцы не нужно кристаллизовать, их можно изучать в средах с различными концентрациями солей и значениями pH, что позволяет установить взаимосвязь между структурой и функцией. Благодаря МУРР на линии B21 Британского Diamond Light Source стало возможным подтвердить, что С-концевая субъединица полимеразы PB2 вируса гриппа А взаимодействует с ГТФазой хозяина Rab11a через образование в растворе компактного складчатого комплекса [50]. На ИСИ Национального центра исследований синхротронного излучения (TPS, Синьчжу, Тайвань) была получена нативная конформация в растворе N-концевой геликазной области белка nsP2, которая обладает нуклеотидтрифосфатазной и РНК-трифосфатазной активностью, и С-концевой цистеинпротеазной области белка nsP2, которая отвечает за процессинг неструктурных полипротеинов вируса чикунгунья, что позволило объяснить ферментативные функции этого вирусного неструктурного белка [51].

Таким образом, ИСИ обеспечивают большой объем методов, позволяющих комплексно исследовать структуру вирусных белков.

Обсуждение. Очень часто на сложные биологические вопросы нельзя ответить, изучая их с помощью одного лишь инструмента, каким бы мощным он ни был. Биологические явления происходят в пространстве и времени, в различных масштабах, в различных условиях. Широкий спектр этих явлений требует гибридных подходов, использующих множество взаимодополняющих инструментов, каждый из которых охватывает различные аспекты проходящих процессов в различных пространственно-временных диапазонах. В идеале для получения полной картины изучаемого явления мы стремимся объединить как можно больше этих инструментов в отлаженный рабочий процесс. Рентгеновские методы, реализованные на ИСИ и обсуждаемые в этом обзоре, составляют фундаментальную основу этих гибридных подходов, приобретают все большее значение для вирусологических исследований и имеют блестящее будущее.

Заключение. В ходе данной работы был произведен анализ возможностей существующих источников синхротронного излучения для проведения вирусологических исследований от макроорганизмов до отдельных вирусных белков, что, в свою очередь, может способствовать созданию новых эффективных противовирусных препаратов. Анализ был выполнен на основе тщательного отбора научной литературы в поисковой системе PubMed, посвященной использованию рентгеновских методов, реализованных на источниках синхротронного излучения. Литературный обзор охватывает широкий исторический период времени начиная с 1958 года и до наших дней и показывает фундаментальную значимость синхротронного излучения для многих вирусологических исследований, общественного здравоохранения и обеспечения биологической безопасности России.

1.  The finest image. [Электронный ресурс] Режим доступа: https://www.esrf.fr/Apache_files/Newsletter/2021/March/1- ESRF-News-March-2021.html#/page/14 (дата обращения: 12.03.2021). 2.  COVID-19/SARSCoV-2 Resources. [Электронный ресурс] Режим доступа: https://rcsb.org/covid19 (дата обращения: 12.03.2021).