Введение. С высокими объемами добычи селена [1] и широким применением связаны потенциальные риски для здоровья человека. Некоторые производственные процессы медеплавильной промышленности являются источниками поступления селенсодержащих наночастиц в воздух рабочей зоны и окружающую среду. К ним относятся переработка медных шламов, обжиг медного колчедана, производство марганца, селена и теллура. Более того, контакт с селенсодержащими наночастицами возможен в стекольном производстве, производстве керамики, в резиновой и химической промышленности и не ограничивается производственной деятельностью.

Помимо производственно-обусловленного действия селенсодержащих наночастиц (НЧ), вызывает опасение целенаправленное их применение. В современной литературе широко распространены данные о положительных свойствах селенсодержащих НЧ – антибактериальных [2][3], противоопухолевых [2–6], антиоксидантных [7]. Ряд исследователей указывают на необходимость применения селенсодержащих НЧ в сочетании с противоопухолевыми средствами, поскольку это не только позволяет несколько ослабить токсическое воздействие химиотерапевтических препаратов [4][8], но и усиливает эффекты противоопухолевой терапии [4]. В определенных дозах их рассматривают в качестве потенциального лекарственного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера [9].

Притом что чаще учитывается их положительное действие, но не токсическое, в современной литературе имеются единичные данные о токсических эффектах селенсодержащих НЧ на клеточном и органо-системном уровне, которые, однако, изучены недостаточно и в небольшом числе экспериментальных исследований с несколько противоречивыми результатами [например, 10–13].

Целью работы являлась оценка влияния на биоэнергетические процессы клеток наночастиц селена как фактора химического риска производственной и окружающей среды для здоровья.

Материалы и методы. Исследования по оценке токсического действия селенсодержащих НЧ были выполнены на примере наночастиц оксида селена (НЧ SeO). Суспензия, содержащая НЧ SeO (форма, приближенная к сферической; средний диаметр использованных частиц 51 ± 14 нм; дзета-потенциал до 42 mV) была получена методом лазерной абляции тонких листовых мишеней из селена 99,99 % чистоты под слоем стерильной деионизированной воды в ЦКП «Современные нанотехнологии» УрФУ.

Оценка действия НЧ SeO in vitro выполнялась на культуре фибробластоподобных клеток линии ФЛЭЧ-104 ООО «БиолоТ» (Санкт-Петербург, Россия). Клетки высевали в 96-луночный планшет и инкубировали в стандартных условиях в течение 48 ч до получения монослоя. Затем в лунки добавляли суспензию НЧ SeO (концентрация НЧ в среде составляла 25, 50 либо 100 мкг/мл) и инкубировали в течение 24 ч в стандартных условиях. Для количественной оценки цитотоксических эффектов применялся анализ биолюминесценции АТФ. Результаты измерений были представлены в относительных единицах люминесценции (RLU). Скорость потребления кислорода клеток определяли с помощью клеточного анализатора метаболизма.

Оценка действия НЧ SeO in vivo была проведена на аутбредных белых крысах-самцах возрастом около 4 месяцев на начало эксперимента по 12 животных в каждой группе. Начальная масса тела животных составляла 200–270 г, диапазон колебания массы животных не превышал ±20 % от средней массы. Субхроническая интоксикация моделировалась путем повторных внутрибрюшинных инъекций 3 раза в неделю в течение 6 недель (всего 18 введений). Выбор доз был проведен на основании результатов ранее проведенных экспериментальных исследований. Вводились растворы стабильной суспензии НЧ объемом 1 мл в разовой дозе 0,2 мг/кг и 1 мл деионизированной воды (группа «НЧ SeO 0,1»); объемом 2 мл суспензии НЧ в разовой дозе 1 мг/кг (группа «НЧ SeO 0,5»); объемом 2 мл суспензии НЧ в разовой дозе 2 мг/кг (группа «НЧ SeO 1»); 2 мл деионизированной воды («Контроль»).

Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с общепринятыми требованиями. Работа одобрена Локальным этическим комитетом ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП, номер протокола № 2 от 20.04.2021.

В качестве показателей состояния биоэнергетического обмена использовали определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) лимфоцитов крови [14].

Метаболомный скрининг проводился с использованием ВЭЖХ-МС. Детектирование осуществляли времяпролетным масс-спектрометром. Полученный массив данных по всем пробам обрабатывали в программном обеспечении, позволяющем выделить статистически значимые изменения содержания метаболитов посредством обработки данных методом главных компонент. Для каждой экспериментальной группы был получен набор значений m/z, статистически значимо изменивших интенсивность в сравнении до и после проведения эксперимента. Для данных масс проводили аннотацию посредством повторного анализа на масс-спектрометре в тандемном режиме с разными уровнями энергий фрагментации для получения характеристических фрагментных спектров и расшифровки структуры. Анализ полученных спектров проводили с использованием общедоступных баз данных (HMDB, MoNA, METLIN, MassBank EU), а также in silico инструментов фрагментации (MetFrag, CFM‑ID, MS-FINDER).

Ультраструктура клеток оценивалась с использованием электронного микроскопа в режиме STEM. Степень повреждения митохондрий определялась по классификации Mei G. Sun исходя из морфологических характеристик (матриксное пространство, количество крист) [15]. К нормальным относили митохондрии типа А (нормальные) и В (нормально-везикулярные), в то время как типы C (везикулярные), D (везикулярно-вздутые), E (вздутые) считали патологически-измененными.

Статистическая значимость межгрупповых различий средних значений всех полученных показателей оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента с поправкой на множественные сравнения. Различия считались статистически значимыми при уровне случайности р < 0,05.

Результаты

Цитотоксичность. В эксперименте in vitro на клеточной линии ФЛЭЧ-104 были получены зависимости АТФ-зависимой люминесценции и скорости потребления кислорода (рис. 1) при воздействии разных концентраций НЧ SeO в инкубационной среде.

Ультраструктурные изменения клеток тканей печени. Процентное соотношение нормальных митохондрий типа А и В по Mei G. Sun составило 87,44 ± 1,14 % в группе «НЧ SeO 1», 94,82 ± 0,95 % в группе «Контроль» при p < 0,05.

Активность сукцинатдегидрогеназы. Результаты измерения активности сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах крови (число гранул формазана в 50 лимфоцитах) представлены на рис. 2. 

Метаболомные исследования. Общее количество метаболитов, идентифицированные метаболиты и изменения их содержания в крови экспериментальных животных представлены в таблице.

Обсуждение. При оценке цитотоксичности НЧ SeO в эксперименте in vitro на клеточной линии ФЛЭЧ-104 было установлено, что токсичность этих наночастиц бывает различной в зависимости от воздействия разных концентраций НЧ SeO в инкубационной среде. Так, НЧ SeO вызывают снижение интенсивности АТФ-зависимой люминесценции, что может говорить о замедлении процессов жизнедеятельности и снижении энергетического потенциала клеток, оцененное на всех исследованных нами концентрациях НЧ SeO в инкубационной среде (рис. 1А). Кроме того, снижалась скорость потребления кислорода митохондриями (рис. 1B).

Изменение параметров, прямо или косвенно говорящих о нарушении функции митохондрий, было установлено и в эксперименте in vivo по изучению токсического действия НЧ SeO на организм животных. При ультраструктурном исследовании методом электронной микроскопии отмечено снижение процентного соотношения нормальных митохондрий в тканях печени. Нарушение ультраструктуры митохондрий приводило к снижению их энергетического потенциала, о котором косвенно судили по статистически значимому, монотонному и дозозависимому снижению активности сукцинатдегидрогиназы под воздействием НЧ SeO (рис. 2). Снижение активности СДГ, вероятно, связано с известной из литературы способностью селена замещать серу в соединениях [16].

Нарушение функций митохондрий подтверждается результатами метаболомного скрининга. Так, было найдено статистически значимое увеличение содержания лизофосфатидилинозитолов [17] в группах НЧ SeO 0,1 и НЧ SeO 1. Лизофосфатидилинозитолы выступают как прекурсоры для синтеза фосфатидилинозитолдии трифосфатов – модификаторов мембран, изменяющих их текучесть и, таким образом, способствующих изменению активности мембранных каналов [18]. Также известно, что процессы спайки и расщепления фосфолипидных мембран, в т. ч. митохондрий, связаны с обогащением последних производными LPI [19]. Кроме того,данные вещества являются лигандами для GPR55 [20] – рецептора, сопряженного с G-белком, опосредующим внутриклеточные сигнальные каскады. Совокупность эффектов, проявляемых парой LPI-GPR55 [19][21–23], может соотноситься с интенсификацией процессов энергетического обмена и регенерации организма в ответ на повреждения, вызванные НЧ SeO. Изменение содержания лизофосфатидилинозитолов в работах по изучению метаболомного отклика организма на действие соединений селена даже в солевой форме ранее выявлено не было.

Во всех опытных группах повышается содержание ацилкарнитинов и их производных согласованно и пропорционально общим изменениям количеств веществ в крови. Данные метаболиты, с одной стороны, переносят жирные кислоты через карнитиновый челнок во внутренних мембранах митохондрий для дальнейшего бета-окисления, с другой – транспортируют излишки продуктов данного процесса из митохондрий и далее во внеклеточное пространство, поскольку избыток оксиацил-КоА производных нарушает функции митохондрий вплоть до инициации апоптоза [24–26]. Вариации в содержании данных веществ свидетельствуют об изменениях в процессе бета-окисления жирных кислот, происходящего в митохондриях, что было показано ранее для воздействия солевых форм селена [27] и впервые показано нами для его воздействия в форме НЧ.

Заключение. Наночастицы оксида селена способны угнетать биоэнергетические процессы в клетке, что мы продемонстрировали как в экспериментах in vitro (снижение интенсивности АТФ-зависимой люминесценции на фибробластоподобных клетках линии ФЛЭЧ-104), так и в исследованиях in vivo (снижение активности сукцинатдегидрогеназы у беспородных белых крыс).

Негативное влияние на энергетическую функцию митохондрий реализуется, по всей видимости, за счет как минимум двух механизмов: нарушения внутримитохондриального β-окисления жирных кислот и инактивации сукцинатдегидрогеназы, чья фундаментальная роль в цепи переноса электронов митохондрий делает ее жизненно важной для большинства многоклеточных организмов.

Такие нарушения обуславливают снижение процентного соотношения нормальных митохондрий в клетках, в первую очередь, печени, являющейся органом-мишенью для воздействия селена.

Полученные в исследованиях in vitro и in vivo результаты могут быть использованы в качестве научной основы для оценки селенсодержащих НЧ как фактора химического риска производственной и окружающей среды для здоровья и поиска подходов к управлению такими рисками. Кроме того, упомянутые изменения могут служить отправной точкой для поиска предикторов ранней диагностики нарушений, опосредованных воздействием селенсодержащих НЧ.